М. С. Томін
Medicus Amicus 2001, #1
Стаття складається з двох частин. У першій частині запроваджується поняття, розкриваються причини, механізми та інші явища, пов’язані з эндотоксемией. Друга — являє методику визначення ендотоксину в крові та інших біологічних рідинах.
1.Грамнегативні бактерії, ендотоксин, эндотоксемия. Грамнегативні бактерії (Escherichia Coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter, Moraxella та ін) часто викликають тяжкі інфекційні захворювання, які можуть бути генералізованими (сепсис) або локальними (перитоніти, пневмонії, пієлонефрити, флегмони). За даними Hurley J. (2001) з числа інфекцій, які були зареєстровані у хворих сепсисом, більше 50% являють собою грамнегативні бактеріальні інфекції [1]. Летальність хворих грамнегативних сепсисом в два рази вище, ніж грампозитивних, в силу патогенних особливостей ендотоксину.
1.1.Ендотоксин (ліпополісахарид, ЛПС)
Бактеріальний ендотоксин є постійним структурним компонентом зовнішньої клітинної стінки грамнегативних бактерій. За структурою це ліпополісахарид. Він складається з довгого ланцюга жирної кислоти (ліпід А), з’єднаної з цукровою ланцюгом, які однакові у всіх грамнегативних бактерій. До серцевини цукрових ланцюга прикріплена варіабельна вуглеводна ланцюжок (О-антиген). Про-антиген унікальний для кожної бактерії і визначає її серотип. Вивільнення ендотоксину відбувається при руйнуванні стінок бактерій. Звільнений ендотоксин проникає в різні рідкі середовища організму (кров, спинномозкова рідина, бронхіальна слиз, сеча). Але саме виникає эндотоксемия призводить до різних патофизиологическим ефектів, ухудшающим стан і, значною мірою, визначає тяжкість клінічного стану хворого. Його біологічна активність зумовлює важкі ускладнення грамнегативних інфекцій.
1.2.Эндотоксемия
Эндотоксемия — циркуляція в крові бактеріального ендотоксину в результаті руйнування грамнегативних бактерій. Деградація або загибель бактерій є результатом великих запальних реакцій (перитоніт, флегмона, септицемія), але може бути викликана і звичайними дозами антибіотиків [2]. Внаслідок деградації відбувається вивільнення великої кількості ендотоксину. Останній зв’язується з циркулюючими в крові білками до СD14-рецепторів лейкоцитів (особливо моноцитів і макрофагів), ендотеліальними і іншими типами клітин. Активовані ліпополісахарид-зв’язуючою білковим комплексом, мононуклеарні фагоцити продукують фактор некрозу пухлини, який в свою чергу індукує синтез інтерлейкіну-1. Фактор некрозу пухлин та інтерлейкін-1 діють на ендотеліальні клітини, що продукують інтерлейкін-6, інтерлейкін-8, адгезивні молекули. Первинне вивільнення ендотоксину призводить до цитокиновому каскаду. Цитокіновий каскад активує вивільнення прозапальних цитокінів макрофагів і підвищує ендотеліальну адгезію молекул для лейкоцитів, посилюючи комплемент-опосередковану реакцію нейтрофілів [3]. Самі макрофаги є альтернативним ом кисневих радикалів, протеаз, метаболітів арахідонової кислоти, фактора активації тромбоцитів і цитокінів, що посилюють запалення. Первинне вивільнення ліпополісахариду призводить до цитокиновому каскаду, який, ймовірно, спрямований на посилення місцевої запальної реакції і посилює кліренс інфекції.
1.3.Ефекти эндотоксемии
Проблема эндотоксемии полягає в здатності ендотоксину, залежно від концентрації в плазмі або від тривалості впливу на клітини тканин, безпосередньо активувати клітини судинних стінок і лейкоцити, або ініціювати каскад цитокінових медіаторів, які визначають клінічний варіант патологічного процесу [4-6].
Низький рівень ендотоксину переважно активує моноцити і макрофаги і відповідно інтенсивність фагоцитозу і секреції цитокінів. Він може ініціювати альтернативний шлях синтезу системи комплементу. Мононуклеарні фагоцити реагують на ендотоксин продукцією фактора некрозу пухлини, який в свою чергу стимулює синтез інтерлейкіну-1. Високі рівні ліпополісахариду призводять до пошкодження ендотеліальних клітин, яке дає початок коагуляційного каскаду.
При тривалому надлишку ендотоксину цитокіновий каскад підсилює синтез вторинних ефекторів — оксиду азоту (NO) і фактора активації тромбоцитів. Ендокринні і паракринные ефекти цитокінів і вторинних медіаторів призводять до системної вазодилатації і гіпотензії, зниження серцевої скоротливості, гіперактивації системи коагуляції, пошкодження і активації ендотелію, системної адгезії лейкоцитів.
Системна вазодилатація і зниження скоротливості серцевого мають наслідком зниження перфузії та гіпоксію. На цьому тлі пошкодження ендотелію, прогресування активації системи коагуляції та присоединяющееся підвищення проникності капілярів реалізуються в наступні клінічні синдроми:
— септичний шок;
— поліорганна недостатність;
— ДВЗ-синдром;
— респіраторний дистрес синдром дорослих.
Перелічені клінічні синдроми можуть викликатися різними етіологічними агентами, але саме ендотоксин є одним з найбільш важливих, визначаючи більш важкий перебіг эндотоксемии [1]. Ефективність лікувальних втручань визначається саме діагностикою самого факту і рівня эндотоксемии.
2. Визначення эндотоксемии
Методи кількісного визначення рівнів ендотоксину в плазмі хворих сепсисом відомі понад 30 років [7], і всі вони засновані на LAL-тесту. Вперше тест був включений в Фармакопею США в 1985 р.
2.1 LAL-тест. Limulus amebocyte lysate (LAL) — це водний лізат з клітин крові (амебоцитов) морського членистоногого,
мечохвостів Limulus polyphemus (рис.). Принцип тесту полягає в тому, що бактеріальні ендотоксини плазми активують в лізаті амебоцитов комплекс ферментів, змінює фізико-хімічні властивості суміші. Відомі 3 методики реалізації тесту: гель-тромб тест, турбідиметричний і хромогенний.
2.2 Гель-тромб тест (GLAL) (PyrotellR — Associates of Cape Cod, Inc) — оригінальний напівкількісний метод LAL-тесту. Проведення реакції не вимагає спеціального обладнання. Методика полягає в додаванні до попередньо розчиненому LAL-реактиву досліджуваного зразка (напр., плазма крові, сеча). Далі пробірку поміщають на водяну баню і інкубують 60 хв. при 37°С. Щільний гель на дні пробірки, не руйнується при її перевертанні, називається позитивною реакцією і означає, що концентрація ендотоксину в пробі більше або дорівнює чутливості LAL-реактиву. Відсутність щільного гелю або його руйнування при перевертанні пробірки називається негативною реакцією і означає, що концентрація ендотоксину в даній пробі злегка або значно нижче чутливості LAL-реактиву.
2.3 Турбідиметричний LAL-тест (Pyrotell-TR — Associates of Cape Cod, Inc) заснований на тому, що в присутності ендотоксину LAL починає мутніти. Швидкість помутніння прямо пропорційна кількості ендотоксину в зразку. Швидкість зростання оптичної густини використовують для кількісного визначення ендотоксину. Метод відносно швидкий, специфічний, простий у виконанні і економічний. Чутливість залежить від виконання протоколу і обладнання. При використанні пристрою, що зчитує LAL-5000 чутливість становить від 0,001 ЕДэ/мл
2.4. Хромогенний LAL-тест (CLAL) (PyrochromeR — Associates of Cape Cod, Inc) заснований на додаванні хромогенного речовини, як більш чутливого індикатора ендотоксину, у присутності LAL.
При наявності ендотоксину LAL набуває жовтий колір. Концентрацію ендотоксину визначають за швидкістю зростання оптичної густини. Максимальна чутливість — 0,005 ЕДэ/мл Для виконання дослідження необхідно зчитувальний пристрій.
Ендотоксин у хворих сепсисом виявляється в крові через 60 годин після початку антибіотикотерапії [3]. Можливо його виявлення і в інших біологічних рідинах (цереброспінальної, сечі тощо). Виявляється тут ендотоксин інтерпретують як достовірний маркер грамнегативної інфекції, але не эндотоксемии [8]. Визначення рівня ендотоксину в сечі, вагінальному секреті, бронхо-альвеолярному лаважі можна використовувати як швидкий метод виявлення інфекцій [9]. В даний час LAL-тест широко використовують також для тестування парентеральних фармацевтичних препаратів.[1].
Висновок
Клінічне значення LAL-тесту полягає у виявленні ендотоксину як надійного маркера грамнегативної інфекції. У разі реалізації ускладнень грамнегативної інфекції (септичний шок, респіраторний дистрес-синдром дорослих, ДВЗ-синдром, поліорганна недостатність) терапія, окрім спеціальної для цих станів, повинна включати заходи, спрямовані на елімінації з крові ендотоксину.
Література
1. Hurley J., J. Labmedica, 18, 3 (2001).
2. Hurley J. C., Clin Infect Dis., 15, 840 (1992).
3. Brandtzaeg P., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 16, 216 (1996).
4. Parrillo J. E., N. Engl. J. Med., 328, 1471 (1993).
5. Ognibene F. O., Adv. Intern. Med., 42, 313 (1997).
6. Glauser M. P., Drugs. 52 (suppl 2), 9, (1996).
7. Douglas G. W., Seller F. K., and Debrovner C. H., Am. J. Obstet. Gynecol., 87, 780 (1963).
8. Jorgensen J. H., Clinical Aspects of Endotoxic Shock, Handbook of Endotoxin., Amsterdam, Elsevier (1986).
9. Hurley J. C., Clin. Micro. Rev., 8, 268 (1995).
