ПЛР — експериментальний метод ранньої діагностики гепатиту C

Вірус гепатиту C (ВГС) — основна причина хронічного захворювання печінки. За неофіційними даними ВООЗ, число інфікованих людей в усьому світі може перевищувати 200 мільйонів чоловік. Більше 50 % діагностованих випадків протікають безсимптомно, виявляються випадково при зверненні в клініку з скаргами на інші захворювання. Хоча саме на ранніх стадіях гепатиту C може бути проведено успішне лікування, яке повністю усуває негативний процес. В останні два десятиліття медицина істотно просунулася вперед в плані ефективної терапії завдяки великим клінічним дослідженням механізму розвитку ВГС, методів профілактики, діагностичних заходів.

Небезпека вірусу HCV (гепатиту C) полягає в його здатності тривалий час маскувати свою суть під безліч інших захворювань. Ще 30 років тому це істотно ускладнювало діагностику, патологія непомітно ставала хронічної форми. Сучасна медицина дозволяє виявляти хворобу на ранніх стадіях, практично відразу після можливого інфікування. Першим кроком стало виявлення в крові хворих вірусної РНК. Подальші дослідження довели, що збудником гепатиту C є РНК-містить вірус, що відноситься до виду Flaviviridae. Діагностичний метод полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) дозволяє виявити вірусну РНК, визначити антитіла до хвороби крові. Аналіз доцільно проводити всім пацієнтам з підозрою на захворювання печінки, включаючи патології нез’ясованої етіології.

Діагностика методом ПЛР

Принцип дослідження заснований на виявленні вірусних фрагментів РНК, їх виборчого синтезу, подальшого поширення. Для аналізу характерна висока ступінь достовірності, специфічність, чутливість, швидкість проведення. Біологічний матеріал досліджується лабораторними методами на предмет кількості і якості молекул РНК, а також для визначення генотипу флавивируса HCV. Тест дозволяє виявити навіть мінімальна кількість інфекційних молекул, ще до утворення антитіл до гепатиту. Від цього факту багато в чому залежить успішність терапії і позитивний прогноз для життя пацієнта.

Генетичне тестування полімеразної ланцюгової реакції складається з декількох етапів:

• Денатурація — руйнування водневих зв’язків між двома ланцюгами ДНК шляхом нагрівання реакційної суміші до 94-96 °C.
• Відпал — в реакцію вводиться праймер (синтетичний короткий фрагмент ДНК довжиною 20-30 підстав), що обмежує виділяється ділянка.
• Елонгація — до кожної ланцюжку ДНК добудовуються праймери, які визначають специфічність реакції і величину вставленого фрагмента.

В процесі тестування відбувається багаторазова реплікація певної ділянки ДНК у штучних лабораторних умовах (in vitro). Сам принцип методики заснований на унікальному властивості ПЛР. Клонується тільки та частина ДНК, в якій є вірусні молекули. Біоматеріал здорового пацієнта робить неможливою реакцію. Рідко виникає ситуація, коли генодиагностика видає хибнопозитивний результат. У цьому випадку призначається повторний тест.

Типи генетичного дослідження

Для збільшення специфічності, чутливості ПЛР-діагностики вірусу гепатиту C, зменшення кількості побічних продуктів реакції існує близько 10 видів дослідження. Для діагностики захворювань печінки найчастіше використовуються:

• ПЛР вкладена (nested-PCR) — послідовно проводяться реакції з двома парами праймерів. Друга пара копіює ділянка ДНК всередині першої реакції.
• ПЛР зворотної транскрипції (Reverse Transcription, RT-PCR). Проводять на продукті м-РНК синтез одноланцюговою молекулою, отримують к-ДНК, яку використовують в якості матриці для полімеразної ланцюгової реакції.
• ПЛР реального часу (Real-Time PCR). Дозволяє в автоматичному режимі моніторити, здійснювати кількісний/якісний аналіз, реєструвати продукти ланцюгової реакції у реальному часі з використанням позначених реагентів або за допомогою мініатюрної відеокамери. Вона передає інформацію з гель-электрофореграммы на монітор комп’ютера. Визначається концентрація досліджуваного зразка в порівнянні з позитивним контролем.
• ПЛР-гібридизація in situ. Використовується для виявлення мінімальних кількостей вірусних РНК, дає об’єктивне уявлення про число заражених клітин, що вкрай важливо для виявлення латентних, маловиражених інфільтративних інфекцій. Матрицею служить вірусна нуклеїнова кислота, кількість якої багаторазово збільшується, тим самим підвищуючи чутливість методу в порівнянні з іншими видами дослідження.

Не можна переоцінити важливість полімеразної ланцюгової реакції при діагностуванні «таємницею» інфекції, коли відсутні сироваткові, вірусологічні маркери гепатиту C в крові. Наприклад, при цирозі печінки невідомої етіології даний метод дозволяє безпомилково ідентифікувати геном HVC або інших інфекцій, прямих збудників захворювання. Генетична діагностика ВГС проводиться одним зі способів — генотипування, секвенування, якісне/кількісне дослідження Real-Time PCR. Вибір способу лабораторного аналізу здійснюється на основі клінічної картини хвороби, результатів попередніх досліджень, попередніх лікарських висновків.

Виявлення гепатиту C методом якісного ПЛР-аналізу

Принцип дослідження багато в чому схожий з класичної полімеразної ланцюгової реакцією. Біоматеріал піддається всім стадіям аналізу — денатурації, відпалу, елонгації. У разі наявності вірусної РНК відбувається реакція. Головна особливість якісного аналізу — здатність виявляти навіть окремий ген. Але при цьому дослідження проводиться з високим ступенем чутливості реагентів — не нижче 50 МО/мл (МО — міжнародна одиниця вимірювання концентрації РНК вірусу гепатиту C в крові).

Існує ймовірність одержання помилкового результату тесту. Наприклад, при низькій чутливості обраного виду дослідження або в перші дні після контакту з інфікованою людиною. Якщо підозри на зараження не зняті, призначається додатковий аналіз з суворим дотриманням вимог:

• стерильний забір біологічного матеріалу;
• чистота лабораторних інструментів;
• виключення прийому хворим противірусних, інших препаратів, що впливають на структуру РНК і склад крові.

З боку хворого потрібен деякий час дотримуватися дієти, припинити прийом медикаментів, відмовитися від куріння. Якщо повторний аналіз показав відсутність збудника, дослідження завершується. При виявленні патогенних маркерів призначається кількісний ПЛР-аналіз.

Кількісний метод виявлення маркерів гепатиту C

Тест проводиться для визначення кількості інфекційних молекул у фіксованому обсязі біоматеріалу для подальшого підрахунку патологічної навантаження на організм в цілому. Дослідження встановлює рівень епідеміологічної небезпеки хворого, стадію прогресу гепатиту C, вид і тривалість противірусної терапії. Під час лікування аналіз призначається для визначення ефективності терапевтичних заходів і чутливості збудників до призначених медикаментів. Повторювати процедуру рекомендується на 2-й, 4-й, 8-й, 12-й і 24-й тижня медикаментозної терапії. Це допомагає скорегувати, збільшити або зменшити дозування препаратів, проаналізувати якість лікування, в разі необхідності ізолювати хворого.

Розшифровкою результатів кількісного тесту займається лікар-гепатолог. Пацієнту можна орієнтуватися на наступні дані:

• показник від 800 000 МО/мл вказує на високий рівень інфекційної навантаження і вимагає негайної госпіталізації хворого;
• 400 000 МО/мл і нижче — з часу зараження відбулося не більше двох тижнів, є можливість купірувати патологічний прогрес.

На підставі дослідження лікар-гепатолог становить клінічну картину захворювання, прогноз для життя пацієнта. Висока достовірність тесту дозволяє виявити гепатит C на доклінічній стадії, що суттєво впливає на ефективність лікування та якість життя хворого.

Забір біологічних матеріалів у пацієнта проводиться з дотриманням стандартних рекомендацій. Аналіз здається вранці, натщесерце, за 12 годин до тесту не вживати алкоголь, не палити, припинити прийом противірусних та інших препаратів, що впливають на структуру РНК.

Генотипування

Генотип вірусу гепатиту C — однорідна група організмів, строго визначеної геномної послідовності. Усередині кожного типу бактеріальних збудників виділяють генотипи, які мають однакові біологічні властивості, репликационную активність, стійкість до антитілам, але розрізняються по своїй структурі, різниця може складати до 15 % нуклеотидних сполук. Ці відмінності визначають особливості різних генотипів вірусу, географічні ареали поширення, здатність до складних мутацій, репликационную активність, характер перебігу хронічного гепатиту C, швидкість формування цирозу печінки та переродження у злоякісні новоутворення — карциному.

Генотип HCV має 11 різновидів, найпоширенішими є 1a, 1b, 2a, 3a, 4. Залежно від етіології захворювання тип геному визначається одним з методів полімеразної ланцюгової реакції. У разі коли обраний вид дослідження не визначає генотип вірусу, призначається більш специфічний аналіз ПЛР.

Секвенування вірусного генома

Спосіб заснований на визначенні нуклеотидної послідовності ДНК і РНК. Дозволяє проаналізувати сегмент довжиною 100-500 нуклеотидних пар, що утворюються при розщепленні кислоти. До початку секвенування проводиться звичайна ПЛР для виявлення ділянки ДНК/РНК, послідовність якого необхідно визначити. Аналіз призначається для виявлення мутують віруси, які можуть змінювати біологічні властивості інфекції та характер перебігу хронічного гепатиту. У ході лабораторного дослідження інформація обробляється в три етапи:

1. Загальні відомості про вірус — розмір геному, ДНК або РНК, фрагментація, поширеність, статус інфекції, зв’язок з найближчими видами, приналежність до антигенної групи і т. д.
2. Аналіз отриманих даних — віднесення вірусу до вірусної групи на підставі імунологічного типування, електронної мікроскопії або по нуклеотидної послідовності геному
3. Анамнез за доступними для дослідника нуклеотидним послідовностям геному вірусу гепатиту C, отримані дані стають основою підбору праймерів для проведення ПЛР.

Безліч штамів, тисячі послідовностей або, навпаки, відсутність в інформаційній базі даних про генотипі вірусу ускладнюють роботу дослідника. Тому важлива висока кваліфікація наукового медичного працівника. Від правильної ідентифікації результатів безпосередньо залежить життя пацієнта і здоров’я його найближчого оточення.

Розшифровка результатів діагностичного ПЛР-аналізу

Отримані результати полімеразної ланцюгової реакції ВГС стають підставою для постановки остаточного діагнозу або призначення додаткових досліджень. Тому правильна ідентифікація показників стає запорукою успішного лікування, якості життя пацієнта та попередження епідеміологічного ризику в середовищі існування передбачуваного хворого. Можливе отримання тільки двох відповідей — позитивний результат ПЛР і негативний. Пріоритетне завдання лікаря — виключити помилкову інтерпретацію, в разі необхідності вжити заходів для виявлення вірусу, наприклад, провести повторний тест, більш чутливий або специфічний.

На точність результатів впливає технологія проведення лабораторних заходів, дотримання правил і медичних рекомендацій. Серйозність і небезпеку захворювання не терпить помилкових висновків — на кону стоять людські життя.

Переваги діагностики ВГС методом ПЛР

Визначення вірусу гепатиту C за допомогою генодіагностики методом ПЛР є найбільш точним, надійним і достовірним способом виявити вірус на ранніх стадіях формування. Гідності дослідження очевидні:

• Пряме визначення ДНК/РНК-збудника інфекції.
• Чутливість дозволяє визначати до 10 копій ДНК.
• Специфічність (достовірність) — 99-100 %.
• Для аналізу використовується будь-який біологічний матеріал. Це може бути кров, сироватка, сеча, харкотиння, плевральної, асцитичної рідина, зіскрібки епітеліальних клітин, а також гістологічні препарати, включаючи фіксовані у формаліні.
• Швидкість обробки результату — 1-2 доби при проведенні звичайного ПЛР-аналізу, а при виконанні real-time PCR — 1-2 години;
• Доступна і постійно знижується вартість дослідження.
• ПЛР виявляє невоспроизводимый вірус, що дозволяє виявити латентну, слабо виражену інфекцію.

Тест допомагає своєчасно виявити вірус-збудник. Присутність навіть однієї молекули штаму гепатиту C в РНК дозволяє точно встановити причину, призначити відповідне лікування і контролювати інтенсивність терапії.