(ЗАТВ. МОЗ РРФСР 02.11.1987)
СТВЕРДЖУЮ:
Заступник міністра
охорони здоров’я РРФСР
К. І. АКУЛОВ
2 листопада 1987 р.
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
КЛІНІКА, ЛІКУВАННЯ ТА ДІАГНОСТИКА ЛЕГІОНЕЛЬОЗУ
Методичні рекомендації підготовлені академіком АМН СРСР,
професором в. І. Покровським, академіком АМН СРСР, професор
С. В. Прозоровським, к. м. н. С. Н.Біленьким, к. б.н. В. С. Тартаковским,
Е. А. Котової, професор, д. м. н. в. І. Васильєвої, к. м. н.
Е. В. Русаковой, В. А. Калашниковим, к. м. н. Ю. Ф. Білим, к. б.н.
О. В. Радченко, В. А. Буникисом, к. м. н. Р. А. Брудным, к. м. н.
Р. В. Гальцевой.
Відповідальний за випуск к. м. н., лікар-епідеміолог Пермської
облсанепідстанції Ст. Д. Медведєв.
За останні роки легіонельоз посів значне місце серед
інфекційних захворювань бактеріальної етіології.
В СРСР легионелльозна інфекція виявляється з 1979 року. Описані
спорадичні випадки і спалах легіонельозу, штами збудника
виділені від хворих та із зовнішнього середовища. Аерогенний шлях зараження,
різноманіття клінічних форм (хвороба легіонерів, лихоманка
понтіак та ін), складність диференційної діагностики, широке
поширення збудника у зовнішньому середовищі вимагають впровадження в
практику охорони здоров’я ефективних методів діагностики і лікування
даного захворювання: контролю за розповсюдженням збудника;
чітких уявлень про особливості клінічного перебігу даного
захворювання.
У методичних рекомендаціях висвітлено сучасні
уявлення про клінічних формах і лікування легіонельозу,
викладено основні методи лабораторної діагностики і
профілактичні заходи.
Методичні рекомендації призначені для практичних
лікарів-терапевтів, пульмонологів, інфекціоністів, бактеріологів,
епідеміологів і гігієністів крайових і обласних СЕС.
1. КЛІНІКА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНОЙ ІНФЕКЦІЇ.
ГОСТРА ПНЕВМОНІЯ
(хвороба легіонерів, легионелла-пневмонія,
піттсбурзька пневмонія)
Основним клінічним синдромом легіонельозу є легеневий,
що відповідає пневмтропной природу збудника. В рамках
респіраторного синдрому легіонельоз представлений трьома клінічними
формами: гостра пневмонія (або хвороба легіонерів,
легіонели-пневмонія, піттсбурзька пневмонія, що викликається
Legionella micdadei), гострий альвеоліт і гострий бронхіт (лихоманка
Понтіак).
Ведуча нозологічна форма легионнелеза — гостра пневмонія,
відрізняється низкою клініко-лабораторних і рентгенологічних
особливостей. Питома значимість легіонельозу в етіологічній
структурі гострих пневмоній досить велика і досягає 15%.
Більшість зарубіжних клініцистів продовжує користуватися
терміном «хвороба легіонерів» для позначення пневмонічної форми
легионеллезной інфекції. Клінічно вона характеризується чітко
окресленою симптоматикою гострої лобарної плевропневмонії, як
правило, важкого та середньотяжкого перебігу.
Провідними клінічними синдромами легіонелли-пневмонії є
лихоманка (до 90%), задишка (80%), виражені плевральні болю (до
75%), кашель (80-90%).
Розгорнутій клінічній картині хвороби в класичному
варіанті передує продромальний період тривалістю від 2
до 10 днів. В цей період хворі відзначали підвищену
стомлюваність, анорексію, помірний головний біль. Типовим
симптомом продромы вважається минуща діарея, не пов’язана з
аліментарної похибкою. Ознаки активності бронхолегеневої
інфекції, катаральні явища носоглотки в продромальний період не
відзначені. Температура у хворих часто залишається нормальною або
помірно субфебрильної (37,5 град. C).
Моментом початку захворювання у всіх хворих легіонельозу
прийнято вважати різке погіршення стану з розвитком астенії,
високою лихоманкою, що супроводжується ознобом, профузної
пітливістю, інтенсивними болями в грудній клітці, пов’язаними з
диханням. Бурхливий початок, як правило, передує швидкому
прогресування інфекційного процесу у вигляді респіраторних
(задишка, кашель, плевральні болю) і генералізованих проявів.
Лихоманка — універсальний перший ознака легионеллезной
інфекції. Більш ніж у 90% хворих легіонельозу відзначений підйом
температури в 1-е добу хвороби до 38,9 град. C; приблизно дві
третини хворих демонструють гарячковий пік 40 град. C.
Пропасниця, як правило, носить ремитирующий характер і переходить в
затяжну (більше 2 тижнів) при важкому варіанті клінічного
течії і неадекватної терапії.
Тахікардія — ознака легионеллезной інтоксикації. Зустрічається
у третини хворих. Деякі автори вказують на відносну
брадикардія (ЧСС 100 при температурі 39,4 град. C) при
легионеллезе, що зближує цю інфекцію з мікоплазменної, вірусної
пневмонію і пситтакозом. Значна ж частина авторів вважає
тенденцію до тахікардії більш характерною для легіонельозу, як і
для інших бактеріальних пневмоній.
Задишка — реєструється у всіх важких і середньо
випадках легіонельозу. Тип задишки визначається як змішаний при
об’єктивно выявляемом тахіпное — до 50 дихань в хвилину. При
філадельфійської спалаху (1976) число дихань перевищувало 25
хв. у 42% хворих. Вираженість задишки можна пов’язати з дією
легионеллезного токсину, а також обсягом і інтенсивністю
консолідації легенів. Легіонельоз нерідко ускладнюється розвитком
гострої дихальної недостатності, майже завжди вимагає
оксигенотерапії. У 20% хворих виникає необхідність у
штучної вентиляції легенів (ШВЛ). Ця група хворих
характеризується високою летальністю.
Болі в грудній клітці плеврального генезу типові для 50-60%
хворих легіонельозу. Больовий синдром варіює від помірного до
різкого. У третини хворих болі строго відповідають інтенсивності і
локалізації розвивається парапневмонического фібринозного
плевриту. Легионеллезное ураження плеври обумовлює больовий
синдром і впливає на ступінь дихальної недостатності.
Кашель характерний для всіх варіантів перебігу легіонельозу і
з’являється в перші 2-3 дні від початку хвороби у 80-90% хворих. У
половини хворих він набуває малопродуктивний характер з
відділенням вкрай мізерною, в’язкого, слизово-гнійного мокротиння.
Кровохаркання — значно менш типово для легіонельозу,
ніж для пневмококової або пневмонії Фрідлендера. Воно відзначено у
менш ніж 30% хворих легіонельозу.
При аналізі клініки легионеллезной пневмонії вдається виділити
деякі загальні закономірності течії та фізикальних даних. При
перкусії визначається притуплення перкуторного звуку під
ураженої зоною легкого, що вказує на переважну
локалізацію запального вогнища в базальних сегментах на
глибині, що не перевищує 4-5 см від поверхні легені. Посилення
бронхофонит і голосового тремтіння іноді передує появі
тупості. При високій щільності пневмонічної інфільтрації над
ураженою ділянкою легені вислуховується бронхіальне дихання.
Аускультативно картина включає вологі хрипи,
звучність яких варіює від глухих до дзвінких. Навіть в
відсутність масивної легеневої консолідації фокальні вологі хрипи
визначаються у більшості хворих легіонельозу. Супутні
сухі хрипи, що вказують на розвиток бронхіальної обструкції,
відзначені у половини хворих легионеллезной пневмонією.
Фізикальні параметри легионеллезной пневмонії суворо пов’язані
з характером легеневого ураження, його об’ємом, типом країн
ускладнень.
Для легионеллезных пневмоній більш характерні правосторонні
вогнищеві або часткові ураження легень, що не можна, однак,
розглядати як патогномонічну ознака легіонельозу, так як
подібна локалізація властива бактеріальних пневмоній
різної етіології. Лигионелла-пневмонію відрізняє від інших
гострих пневмоній порівняльне різноманітність і локалізацій
значна питома вага тотальних і субтотальних пневмоній
(21%).
Рентгенологічна характеристика легеневого ураження при
легионеллезе схематично представлена двома формами: одностороння
плевропневмонія і двостороння вогнищево-інфільтративна пневмонія.
Абсцедирування та інші види легеневої деструкції поряд з
емпієма плеври і пневмотораксом нетипові для легіонельозу і частіше
зустрічаються у хворих з наявністю імунодефіциту різного генезу.
Дві третини хворих легіонелли-пневмонією демонструють
прогресування процесу на рентгенограмі в перші 2-5 діб
хвороби з подальшою билатерализацией. Диференціальним
рентгенологічною ознакою легіонелли-пневмонії є
тривале вирішення запальної інфільтрації і плевральних
змін, навіть на фоні етіотропної терапії. У 50% хворих ті або
інші зміни виявляються на рентгенограмі через 3 місяці після
одужання. Близько третини хворих легиоеллезом дають результат
пневмонії у вогнищевий пневмосклероз часто зі стійкою реакцією
плеври.
Позалегенева клінічна симптоматологія відрізняється достатньою
різноманітністю і супроводжує важке і середньої важкості перебіг
інфекції.
Неврологічні порушення. Переважним типом
легионеллезного ураження ЦНС є дифузна токсична
енцефалопатія. Стовбур головного мозку та мозочок — головні мішені
легионеллезного ураження ЦНС, які виявляються у вигляді дизартрії,
атаксії, ністагму і паралічу погляду, у 10 разів частіше, ніж у хворих
гострою пневмонією іншої етіології.
Серед найбільш важких неврологічних розладів при
легионеллезе — мозкова кома, эпистатус. Ураження периферичної
нервової системи включає моторні неврити. На ЕЕГ виявляються, як
правило, неспецифічні зміни, характерні для токсичної
ураження мозку. При легионеллезе відзначені випадки розвитку
делірію, енцефаломієліту.
Ураження м’язового і кістково-суглобового апарату
Токсичне ураження м’язів при легионеллезе варіює від
розлитої міалгії з м’язовою слабкістю до рабдоміолізу.
Останній є проявом тяжкої інтоксикації,
супроводжується, як правило, гострою нирковою недостатністю
підвищеним вмістом КФК в плазмі.
Шлунково-кишкові розлади
Найбільш типовим проявом є минуща діарея,
виявляється в першу добу захворювання або в короткому періоді
продрома; відзначена у 10-15% хворих легіонельозу. За зменшенням
частоті реєструються нудота, блювота, болі в животі, які, як
і діарея, приурочені до перших діб хвороби, а іноді
передують розвитку респіраторного синдрому. Казуїстикою
є розвиток гострого панкреатиту, гострого апендициту, гострої
кишкової непрохідності, жовтяниці.
Ураження нирок, серця
Ураження нирок при легионеллезе маніфестують, головним
чином, у вигляді гострого вогнищевого нефриту. Ускладненням, і нерідко
важким, легионелла-пневмонії є гострий канальцевий некроз,
призводить до прогресуючої ниркової недостатності і летального
результату, як правило, на тлі токсичного шоку і судинного
колапсу.
Серед уражень серця виділяють рідкісні епізоди розвитку
легионеллезного міокардиту і перикардиту. Причому останній, як
правило, пов’язаний з масивним ураженням плеври.
Аналіз секційного матеріалу більш ніж в 70% випадків
легіонельозу вказував на збільшення селезінки і подальше
виявлення збудника з органу. При цьому спленомегалія клінічно
фіксується вкрай рідко. Патогенез дисемінованого характеру
ураження вивчений недостатньо. Щорічно реєструються випадки
сепсису, як при епідеміях, так і при спорадичних випадках.
Цитолитические і некротичні процеси в інфікованих
тканинах, характерні для легіонельозу, вказують на важливу роль у
розвитку хвороби легіонерів токсичних факторів, що руйнують
мембрани клітин-мішеней — цитолизинов.
Лабораторні параметри при легионеллезе і
морфологічна оцінка інфекції
Аналіз крові. Лейкоцитоз характерний для 50-75% хворих
легіонельозу в дебюті захворювання. Вміст лейкоцитів вище
10000/мл виявляється у 25% хворих; 15000-20000/мл — у половини
хворих. Нейтрофільоз з характерним зсувом формули вліво
зустрічається у понад 80% хворих легіонельозу.
Досить типовим для легіонельозу вважається відносна
лімфопенія (1000/мл), відзначається у 2/3 хворих. Значне
прискорення ШОЕ (до 100 мм/год) характерно для легіонельозу: 60 мм/год.
у 65% хворих.
Біохімічні параметри
Гіпонатріємія (130 мм/л) на початку захворювання — 50-60%
хворих. Титри ферментів печінки (АЛТ, АСТ) підвищені у 50-75%;
гіпоальбумінемія і гіпофосфатемія реєструються, відповідно,
у 65% і 50% випадків хвороби.
Аналіз сечі. Розвиток протеїнурії, частіше слідової, виявляється в
50% випадків, що обумовлено лихоманкою і вогнищевим нефритом.
Мікрогематурія зустрічається у 30-50% хворих.
Аналіз мокротиння і плевральної рідини
У убогою мокротинні, характер якої визначається, як
слизовий або слизово-гнійний, виявляється велика кількість
нейтрофілів і альвеолярних макрофагів.
Звичайна забарвлення за Грамом не дозволяє виділити або хоча б
запідозрити легионелл. Цитограма плевральної рідини носить
риси запального ексудату з великим вмістом
поліморфно-ядерних лейкоцитів. В окремих випадках можливо
виділення збудника з плеврального ексудату і верифікація
діагнозу легіонельозу методом прямої імунофлюоресценції.
Морфологічна характеристика інфекції
Мікроскопічно провідним органом-мішенню легионеллезной
інфекції є легені і плевра.
Як правило, при патологоанатомічному дослідженні виявляється
різна ступінь консолідації легеневої тканини на стадії червоного
або сірого опеченения. Деструкція легень відноситься до випадків
інфекції на фоні імунодефіциту і в цілому типовою для
легіонельозу. Випіт в плевральну порожнину, серозний або
серозно-геморагічний, виявляється майже у всіх летальних
випадках легіонельозу, тоді як емпієма плеври вважається рідкісною
знахідкою.
Найбільш типовими мікроскопічними ознаками легіонельозу
розглядають макрофагальную і нейтрофильную інфільтрацію альвеол,
супроводжується утворенням фібрину і экстравазацией
еритроцитів.
Диференційно-діагностичним морфологічним ознакою
легіонели-пневмонії служить коагуляційний некроз і септальний
набряк альвеол без вираженого гнійно-деструктивного процесу в
тканини легень. Диференційною ознакою патоцитологическим
легіонельозу є персистенція збудника в макрофагах, що,
на думку багатьох дослідників, пояснює випадки рецидивування
інфекції.
Диференціальна діагностика легіонелли-пневмонії
Диференціальний діагноз проводиться з мікоплазма-пневмонією,
пситтакозом, Ку-лихоманкою, туляремію, цитомегаловірусної та
пневмококової пневмонії.
Легионелльозна пневмонія характеризується наступними
особливостями: висока лихоманка, важкий перебіг, відсутність
ураження верхніх дихальних шляхів на початку і продромі
захворювання, різноманітність локалізацій легеневого ураження, часте
розвиток тотальних і субтотальних уражень легень, плевриту і
позалегеневих проявів інфекції (токсична дифузна
енцефалопатія, міалгія і поліартралгія, ураження нирок, серця),
наявність лабораторних зрушень (нейрофілез, лімфопенія,
гіпоальбумінемія, гіпонатріємія, підвищення титрів АЛТ, АСТ, КФК,
мікрогематурія, протеїнурія).
На додаток до зазначених клініко-лабораторних і
рентгенологічним параметрами для диференціації від інших
захворювань необхідно враховувати епідеміологічний анамнез і
наявність факторів ризику: середній та похилий вік, весняно-літній
період розвитку хвороби, фактор подорожей, проживання в
готелях, контакти з землею, прісними водоймами, системами
примусової вентиляції та водяного опалення, участь у
будівельних роботах, наявність в анамнезі різних соматичних
захворювань (ХОЗЛ, цукровий діабет, колагенози,
лімфопроліферативні захворювання) і чинників первинного і
вторинного імунодефіциту, вживання алкоголю, куріння тощо
Крім цього необхідно підтвердження діагнозу за допомогою
різних лабораторних тестів.
Гострий альвеоліт
Легіонельоз відноситься до первинно-альвеолярним інфекцій, і
розвиток альвеоліту є відображенням особливостей аеродинаміки
збудника, дифузно вражаючого альвеоли. Мікробний аерозоль
діаметром 0,5-2 мкм здатний досягати термінальних бронхіол і
альвеол, звідки його кліренс неможливий через відсутність
циллиарного апарату. Основним патогенетичним механізмом,
визначальним картину хвороби при легионеллезном альвеолите,
є набряк і ущільнення міжальвеолярних перегородок і
навколишнього интерстация, а також клітинна ексудація в альвеоли.
Загальним для клінічного перебігу легионеллезного альвеоліту і
пневмонії є гострий початок захворювання з високою лихоманкою
і астенічним синдромом. Для всіх хворих альвеолитом типові
скарги на прогресуючу задишку змішаного типу, що тиснуть болі за
грудиною, імітуючи стенокардію, сухий, рідше малопродуктивний
кашель. При аускультації легень виявляється патогномонічний для
альвеоліту акустичний ознака — поширена двостороння
крепітація, краще выслушиваемая в симетричних базальних відділах
легких. Альвеолярна крепітація, іноді звана «целофановою»,
за своїми акустичними характеристиками легко можна відрізнити від вологих
хрипів при пневмонії. Крепітація обумовлена переважним
розподілом уражених альвеол у підставах легень під впливом
генералізованого підвищення проникності капілярів при
легионеллезном альвеолите.
На відміну від пневмонії при легионеллезных альвеолитах не
відзначено вогнищево-інфільтративних і плевральних змін.
Двостороннє обмеження стояння куполів діафрагми є
характерним рентгенологічним ознакою альвеоліту.
Іншим диференційно-діагностичним критерієм альвеоліту
вважають порушення вентиляційної функції легень переважно за
рестриктивному типу. Зниження життєвої і загальної ємності легень при
легионеллезной альвеолите пов’язано зі зміною еластичності легенів
і частковим колапсом базальних сегментів.
Відмінностей у лабораторних показниках при гострій легионеллезной
пневмонії і альвеолите не виявлено.
Легионеллезный альвеоліт маніфестує, як правило, важкий
варіант легионеллезной інфекції і реєструється як спорадично,
так і у вигляді обмежених спалахів (Армавір, 1987). При вивченні
рентгенограми хворих епідемічним варіантом легионеллезного
альвеоліту з’являються ознаки легеневого васкуліту, нерідко і
супутня реакція плеври.
Лихоманка Понтіак
Непневмоническая форма легіонельозу — лихоманка Понтіак — за
назвою міста в штаті Мічиган (США), де відбулася перша
відома спалах хвороби в 1968 році. Ретроспективний аналіз
сироваток від хворих в цю епідемію вказав на легионеллезную
етіологію захворювання. Клінічна картина хвороби представлена
грипоподібним синдромом: 1-2-денна лихоманка (температура до 40
град. C) з ознобом, сухим кашлем, катаральними явищами
носоглотки (30% хворих). Інкубаційний період хвороби становить
36-48 годин. Незважаючи на розвивається при лихоманці понтиакской
респіраторну та нереспираторную симптоматику (головний біль і
запаморочення — 50-60%, міалгії — 30%, діарея — 25%), захворювання
протікає в легкій формі з регресом клінічної картини в
короткі терміни (2-7 днів). Летальні наслідки при понтиакской
лихоманці не зареєстровані. Ця форма легіонельозу виявляється,
виключно в епідемічному варіанті. Епідемії лихоманки
Понтіак, як правило, несуть пневмонический «шлейф» (до 10%
уражених інфекцій).
Спорадичний аналог понтиакской лихоманки — гострий бронхіт —
має ті ж клінічні параметри.
Питання про те, чому один збудник — Legionella pneumophila
— викликає розвиток різних клінічних варіантів інфекційного
ураження людини, залишається невирішеною, незважаючи на значний
прогрес медичних знань щодо цієї нової бактеріальної легеневої
інфекції.
2. ЕТІОТРОПНА І ПАТОГЕНЕТИЧНА ТЕРАПІЯ
ЛЕГІОНЕЛЬОЗУ
Антимікробна терапія легионеллезной інфекції
Вибір антибіотика при лікуванні гострих пневмоній завжди
представляє складну клінічну задачу, що вимагає враховувати цілий
ряд факторів. Ефективність антибактеріальної терапії слід
розглядати за традиційними критеріями: нормалізація або
значне зниження температури в перші 48 годин від початку
лікування, поліпшення клінічного стану хворого, позитивна
аускультативно динаміка над легенями у вигляді зменшення кількості,
поширеності і звучності хрипів та крепітації. Антибіотиком
при лікуванні легіонельозу є еритроміцин. Добова доза
препарату 2,0 г (0,5×4) для перорального прийому адекватна легкому
перебігу захворювання. Терапія повинна бути почата при наявності
підозри на легіонельоз ex juvantibus і при отриманні
клінічного ефекту продовжено незалежно від результату
лабораторного дослідження.
Тривалість курсу антибактеріальної терапії при її
ефективності складає в середньому 10-12 днів. Середньотяжкий і
тяжкий перебіг захворювання, як правило, вимагає застосування
великих дозувань еритроміцину: 4,0 г/добу. (1,0×4) внутрішньовенно.
При недостатньому клінічному ефекті поєднання раціонально
еритроміцину з рифампіцином (ріфадін, бенеміцін, римактан) в
добовій дозі 1,2 г (0,6×2) на пероральний прийом. При стійкій
нормалізації температури, регрес інших клінічних параметрів
пневмонії доцільно здійснити перехід від внутрішньовенного на
пероральний прийом еритроміцину з 4-5-го дня від початку лікування за
знижує дозування (4,0-2,0 г/сут.). Тривалість
антимікробної терапії визначається динамікою процесу під впливом
лікування і при середньотяжкому і тяжкому варіантах перебігу коливається
у межах від 2 до 3 тижнів. Однак при необхідності (повільно
дозволяється процес в легенях, стійкий субфебрилітет) курс
лікування може тривати 1,5-2 міс. Антибактеріальна терапія
еритроміцином при його доведеної клінічної ефективності та
встановленому лабораторному діагноз легіонельозу може бути
відновлена при рецидиві інфекції. Там, де лікування еритроміцином
з різних причин неможливо, рекомендується застосовувати доксициклін
(вібраміцин, доксимицин) за наступною схемою: 200 мг перша доза;
100 мг через 12 год.; 100 мг — щодня. Тривалість
курсу — 10-14 днів. При середньотяжкому і тяжкому перебігу
легіонельозу ефективно поєднання доксицикліну та рифампіцину.
Вважається неефективною монотерапія рифампіцином через
бистроразвівающейся резистентності до препарату.
Відсутність ефекту від лікування пеніциліном і його
напівсинтетичними дериватами, а також цефалоспоринами може
служити непрямим діагностичним маркером легіонельозу.
За даними, заснованим на 5-річному досвіді вивчення легіонельозу
у США, летальність у випадках інфекції на фоні імунодефіциту
досягала 80%, якщо лікування не використовувався еритроміцин.
Коли терапія еритроміцином проводилась своєчасно у
адекватних дозах, летальність при епідеміях зменшувалася в 4-6
раз. Можливо також интраплевральное застосування препарату,
показане при наполегливому фібринозно-гнійному плевриті або вторинної
емпіємі плеври. Одноразове введення еритроміцину в плевральну
порожнину в дозі 250-500 мг підтримує активну концентрацію
препарату протягом 3 днів.
Як для внутрішньовенного, так і интраплеврального введення
застосовується вітчизняний препарат — эритромицинфосфат, добре
розчинний у воді і що випускається у флаконах по 100 мг. Для прийому
всередину використовується еритроміцин в дозі 0,25 г в одній таблетці,
іноді — 0,1 г, що значно менш зручно, особливо при
тривалому лікуванні.
Слід підкреслити, що побічні явища при лікуванні
еритроміцином: нудота, блювання, діарея — виявляються вкрай рідко.
Незначна і частота алергічних реакцій при лікуванні препаратом —
0,5%.
Таким чином, провідною ланкою в тактиці етіотропної терапії
всіх клінічних форм легіонельозу є еритроміцин в добовій
дозі 2,0-4,0 г, тривалість прийому якого складає
середньому 14 днів. Перспективним напрямком у антимікробної
терапії легіонельозу вважають використання нових синтетичних
препаратів групи макролідів та похідних оксихинолиновой
кислоти, ровамицин (Франція), таривид (ФРН), ефективність
яких, за попередніми даними, щодо цієї інфекції
оцінюється вище, ніж еритроміцину.
Принципи патогенетичної терапії легіонельозу
Кортикостероїди абсолютно показані при розгорнутій клінічній
картині легионеллезного альвеоліту, ускладненого гострою
дихальною недостатністю. Максимальна початкова доза
стероїдів при лікуванні легионеллезного альвеоліту становить 30-40
мг/добу. у преднизолоновом еквіваленті.
Тривалість стероїдної терапії знижує схемі з відміною
не перевищує, як правило, 3 тижнів. У випадках, де легіонельоз
представлений тяжкою гострою пневмонією, що проявляється симптомами
вираженої інтоксикації, плевральним синдромом, артеріальною
гіпотензією або колапсом, стероїдна терапія також необхідна:
преднізолон — до 240 мг/добу. для внутрішньовенного введення до
купірування грізних синдромів (2-5 днів). Кортикостероїди
рекомендується застосовувати короткими 5-10-денними курсами в добовій
дозі 20 мг преднізолону з відміною при легионеллезной пневмонії,
ускладненої парапневмоническим плевритом. Заслуговує уваги
препарат, який знайшов широке застосування в практиці лікування гострих
пневмоній, — презоцил (ВНР). Препарат являє собою
комбінацію преднізолону (0,75 мг), делагина (0,25 г) і аспірину
(0,2 г). Презоцил застосовується по 2 табл. 3-4 рази в день протягом
12-14 днів з подальшою відміною. Синдром відміни і гіперглікемія
при лікуванні всіх клінічних форм інфекції легионеллезной
кортикостероїдами не зареєстровані.
Обструктивні порушення легеневої вентиляції виявляються в 95%
випадків пневмонії, особливо в гострий період хвороби. Тому
доцільним вважається застосування бронхолітиків при
легіонели-пневмоніях: теофедрин 1/2 табл. 3 рази в день (12-14
днів).
При лікуванні легіонельозу досить широке застосування має
неспецифічний імунокоректор метилурацил, який призначається
поза гострої фази, тобто, як правило, з другого тижня від початку
лікування.
Виправдано і рекомендовано застосування водорозчинній камфори
сульфокамфоракаин 20%— 2,0-4,0 3 рази на день, в/м, при всіх
формах легіонельозу, так як препарат сприяє зниженню
легеневої гіпертензії.
Посиндромная терапія повинна включати легіонельозу
дезінтоксикаційні засоби (гемодез, реополіглюкін),
оксигенотерапію, трансфузії нативної плазми та інші замінники
протеїнів.
З дезагрегантной метою при тяжкому і середньотяжкому перебігу
інфекції показане застосування гепарину, аспірину. При некротичних
процесах в легеневій тканині доцільно використання інгібіторів
протеаз (контрикал, гордокс).
У кожному випадку характер терапії диктується конкретною
клінічною ситуацією.
Резюмуючи этиотропный і патогенетичний підходи до терапії
легіонельозу, слід підкреслити необхідність індивідуалізації
лікувальної програми з урахуванням викладених принципів. Така тактика
довела свою перевагу перед канонізованої терапією
практиці лікування гострих запальних захворювань легень
різної етіології.
3. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА
В даний час використовують три основні групи методів
лабораторної діагностики:
1. Серологічні методи.
2. Бактеріологічні методи.
3. Експрес-методи виявлення збудника та його антигенів.
Серологічні методи отримали найбільше поширення для
діагностики легіонельозу в зв’язку з простотою їх виконання і
доступністю практичних лабораторій. Наростання діагностичних
титрів до збудника легіонельозу в будь-яких двох із трьох
рекомендованих серологічних реакцій з високим ступенем надійності
підтверджує діагноз. До недоліків методу відноситься
ретроспективний характер діагностики у зв’язку з необхідністю
відбору 2-ї сироватки на 2-3-й тиждень захворювання.
Бактеріологічні методи є головними для остаточного
відповіді про наявність спалаху легионеллезной інфекції. Однак
застосування їх на практиці вимагає спеціальної підготовки
персоналу. Виділення культури окремо або із зовнішнього середовища і її
попередня ідентифікація займають не менше 2-3 тижнів.
З високочутливих і специфічних методів
експрес-діагностики найбільше поширення отримала пряма
імунофлюоресценція. Однак спектр досліджуваного матеріалу той же,
що і при виділенні культури, рідко дозволяє поставити діагноз
перші дні захворювання. Імуноферментний метод дає можливість
виявити легионеллезный антиген у сечі хворих вже на 3-5-й день
хвороби.
Впровадження в практику роботи клінічних установ
експрес-методів дозволить значно прискорити постановку діагнозу
і своєчасно почати етіотропну терапію.
СЕРОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ
1. Реакція непрямої імунофлюоресценції (РІФ)
Техніка постановки
На чисте знежирене предметне скло наносять 3 окремих
невеликих краплі легионеллезного антигену, в якості якого
використовують вбиту кип’ятінням 2-добову культуру L. pneumophila,
вирощену на вугільно-дріжджовому агарі, що містить L-цистеїн (0,4
г/л) і пірофосфат заліза, розчинний (0,25 г/л) в атмосфері 5%
CO2. У роботі використовують антиген із штаму L. pneumophila
Philadelphia I в робочому розведенні (40 бактеріальних клітин в
поле зору в фазоконтрастном мікроскопі). Після підсушування
антигену на повітрі протягом 10-15 хвилин препарат фіксують в
ацетоні 15 хвилин і знову підсушують протягом 2-3 хвилин на
повітрі при кімнатній температурі. Після фіксації препарату
антиген на стороні мазків слід обвести склографом, що в
надалі перешкоджає злиттю крапель сироватки в різних
розведеннях. Скла з антигеном поміщають у вологу камеру (чашка
Петрі з вологою фільтрувальним папером на дні), і препарати з
антигеном обробляють сироваткою хворих в розведеннях 1:32,
1:64, 1:128. Перше розведення сироватки 1:8 роблять у 0,5%
розчині яєчного жовтка в забуференному фізрозчині (pH = 7,2),
наступні дворазові розведення сироватки проводять в
забуференному фізрозчині. Препарат антигену з сироваткою
інкубують 30 хвилин при температурі 37 град. C у вологій камері,
після чого промивають 5-10 хвилин фосфатним буфером (ФСБ) pH = 7,2,
дистильованою водою і висушують на повітрі. Далі препарат
обробляють люмінесцирующою сироватку проти глобулінів
людини, взятої в робочому розведенні. Інкубують 30 хвилин при
температурі 37 град. C у вологій камері, промивають 5-10 хвилин
ФСБ pH = 7,2, споліскують дистильованою водою, висушують на
повітрі і наносять середу з гліцерином, покривають покривним склом.
Такий препарат готовий для перегляду в люмінесцентному мікроскопі.
При постановці реакції імунофлюоресценції необхідно робити
позитивний контроль (антиген з позитивною кролячої
легионеллезной сироваткою) та негативний контроль (антиген з
нормальною сироваткою).
Облік і оцінка реакції
Препарат микроскопируют в падаючому світлі люмінесцентного
мікроскопа ЛЮМАМ. Для мікроскопії використовують іммерсійне об’єктив
90x (1,25) і окуляр 5×7 і нефлюоресцирующее иммерсионное масло.
У позитивних випадках, тобто коли досліджувана сироватка
містить специфічні антитіла, після обробки даного препарату
люмінесцирующою сироватку проти глобулінів людини виявляється
специфічне яскраве зелено-жовте світіння бактерій на темному фоні
препарату. При специфічній флюоресценції вдається виявити
більш яскраве світіння по периферії бактеріальної клітини і більше
слабке в її центральній частині. Для оцінки інтенсивності
специфічного світіння використовують четырехкрестовую систему: + + +
+ — яскраві, блискучі смарагдово-зелені клітини, люмінісцентні за
периферії, чітко контрастують з темним тілом клітки; + + + —
помірна смарагдово-зелена люмінесценція по периферії клітини; + +
— зелене світіння всієї клітини; + — ледь помітна зелена
люмінесценція всієї клітини. Позитивним результатом вважають
флюоресценцію, яка оцінюється на «+ + + +» і «+ + +». За титр
досліджуваної сироватки приймають останнє розведення, яке
забезпечує бактеріальної клітці специфічне світіння,
оцінюване на «+ + + +» і «+ + +». Розведення сироватки, при
якому зазначається слабке світіння бактеріальної клітини,
оцінюване на «+ +» і «+», не враховують.
Позитивний контроль (препарат антигену з позитивною
кролячої легионеллезной сироваткою) повинний давати яскраве
специфічне світіння легіонел, в негативному контролі
(препарат легионеллезного антигену з нормальною кролячої
сироваткою) світіння відсутня повністю.
Більшість хворих легіонельозу має виражену
сероконверсію з наростанням титрів антитіл у 4-128 раз в
сироватках реконвалесцентів, у порівнянні з першою сироваткою,
отриманої в гострий період захворювання. У випадках, коли
проаналізувати динаміку зміни не представляється можливим,
діагноз ставиться за високим рівнем специфічних антитіл (титр не
менше 1:64). Поява специфічних антитіл у окремих хворих
може відбуватися вже до 6-7-го дня від початку захворювання. Титри
швидко зростають на 2-3-му тижні, досягаючи максимальних значень
до 5-го тижня від початку захворювання. У наступні місяці титри
зменшуються. Необхідно враховувати можливість виявлення
перехресних реакцій сироватки хворих легіонельозу в РИФ з
антигенами пситтакоза і лихоманки КУ. Однак титр антитіл в
реакції з гомологічною культурою зазвичай буває вище, ніж з
гетерологичной, що є основою для диференціальної
діагностики.
2. Реакція імуноферментного аналізу (ІФА)
Техніка постановки реакції
В лунках полістеролового планшета вносять по 100 мкл
розчинного антигену L. pneumophila в концентрації 1-10 мкг/мл в
фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) pH = 7,2. Планшети інкубують при
температурі 37 град. C протягом 2 годин або протягом 18 годин
при температурі +4 град. C. Потім планшети тричі відмивають у ФСБ з
0,05% твіну-20 і просушують. В лунки сенсибілізованих
планшетів вносять послідовно дворазові розведення досліджуваних
сироваток (або крові) в об’ємі 100 мкл. Розведення сироваток
роблять на ФСБ з 0,05% твіну-20. Початкове розведення сироваток
1:100. Інкубація 1 годину при температурі 37 град. C. Потім планшети
тричі відмивають за 5 хвилин ФСБ з 0,05% твіну-20.
В лунки відмитого планшета вносять кон’югат в робочому розведенні
в об’ємі 100 мкл (кролячі імуноглобуліни до сироватковим
глобулінів людини, мічені пероксидазою хрону, виробництва
НИИЭМ їм. Н.Ф.Гамалії АМН СРСР). Кон’югат розводять тим же буфером
з твином-20. Після 1-годинної інкубації при температурі 37 град. C
лунки планшета ретельно відмивають від непрореагировавшего
кон’югату. Потім в лунки планшета вносять по 100 мкл
свіжоприготованого субстрат-індикаторного розчину, що містить
0,04% O-фенилендиамина в 0,1 М цитратно-фосфатному буфері рн = 6,0 в
присутності 0,006% H2O2. Інкубують 30 хвилин у темряві при
кімнатній температурі. Реакцію зупиняють рівним об’ємом 1 н
розчину сірчаної кислоти.
Облік результатів
Інтенсивність забарвлення визначають візуально або
спектрофотометрично при довжині хвилі 492 нм. Результати
дослідження вважають позитивними, якщо титр дослідженої
сироватки перевершує титр негативного контролю більш ніж на 2
розведення при візуальному обліку результатів реакції, або
оптична густина (ОГ) досліджуваної сироватки більше ніж у 2
рази перевищує показання ОГ негативного контролю при
фотометричному обліку.
За позитивні результати беруть наявність антитіл до L.
pneumophila в титрах 1:400 і вище.
БАКТЕРІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ
Збудник рідко вдається виділити від хворого. Для
дослідження беруть матеріал бронхоскопії, плевральну рідину,
легеневий ексудат. Описані поодинокі випадки виділення збудника
з мокротиння, крові. Значно частіше виділяють збудник з
секційного матеріалу (легеневої тканини). При бактеріологічному
дослідженні на легіонельоз застосовують посів на спеціальні
живильні середовища і біологічну пробу на чутливих
тварин.
1. Посів на живильні середовища
Збудник легіонельозу не росте на звичайних поживних
середовищах, в тому числі дуже багатих (м’ясо-пептонний агар, агар
Хоттингера, триптически-соєвий агар, середовища на серцево-мозковому
екстракті та ін).
На шоколадному та кров’яному агарі можливий слабкий ріст мікроба в
першої генерації при масивних посівах культури.
Виділення збудника від хворих та із зовнішнього середовища проводять
на спеціальних поживних середовищах, які застосовуються для культивування
легіонел з обов’язковим додаванням L-цистеїну та розчинної
пірофосфату заліза. Найбільшого поширення набула
вугільно-дріжджова середовище. Хороші результати отримані при заміні
дріжджового екстракту на сірчанокислий гідролізат рыбокостной борошна.
При цьому концентрація додається в середу L-цистеїну знижується в
2 рази. Для запобігання пророста сторонньої мікрофлори при
дослідженні контамінованого матеріалу і зразків зовнішнього середовища
до аґару додають антибіотики (поліміксин М 40 од./мл + пеніцилін
0,5 мкг/мл + амфотерицин Б 80 мкг/мл).
При підготовці до висіву рідкі зразки розводять 1:10 фосфатним
буфером (pH 7,2). Висівають розведений і цілісний зразок
кількості 0,2 мл При дослідженні секційного матеріалу шматочок
тканини масою 1 г розтирають у стерильній ступці товкачиком і готують
10% суспензію тканини у фосфатному буфері (pH 7,2). Приготовану
суспензію розводять 1:50 тим же буфером і висівають на середовища.
Ріст колоній з клінічного матеріалу спостерігається не раніше
ніж через 4-5 діб. Максимальна кількість вводяться колоній
зазвичай зростає на 8-10-ту добу. При підозрі на зростання легіонел
колонії пересівають на ту ж середовище та на середовище, що не підтримує
зростання легіонел (контрольне середовище). В якості контрольної середовища
зазвичай використовують агар Хоттингера або триптически-соєвий агар.
Ріст колоній у другому пасажі на вугільно-дріжджовий або
рыбокостной середовищі при відсутності росту на контрольному середовищі з
великою часткою ймовірності дозволяє запідозрити легіонельоз і
вказує на необхідність подальшої ідентифікації.
З метою отримання культури збудника легіонельозу від
биопробных морських свинок рекомендується проводити посів
селезінки биопробного тваринного одночасно на 3 чашки з
такими середовищами:
1. Вугільно-дріжджовий агар.
2. Вугільно-дріжджовий агар з антибіотиками.
3. Агар Хоттингера.
Вугільно-дріжджова середовище може бути замінена на рыбокостную
середовище. При загибелі тварини від легіонельозу посів повинен бути
позитивним на перших двох чашках. При загибелі від іншої інфекції
зростання збудника буде відзначатися на 1-й і 3-й чашках і
відсутня у 2-й.
Вугільно-дріжджова середа: дріжджовий екстракт — 10 р,
активоване вугілля — 2 г, L-цистеїн — 0,4 г, пірофосфат заліза
розчинна — 0,25 г, K2HPO4 — 0,85 м, KH2PO4 — 1,0 г, агар — 17
г, дистильована H2O — 980 мл
Всі компоненти середовища крім L-цистеїну і пірофосфату заліза
додають до 980 мл дистильованої води, розчиняють, доводячи до
кипіння, і автоклавують 15 хвилин при температурі 121 град. C.
Середовище охолоджують до 50 град. C і додають свіжоприготовані
розчини L-цистеїну (0,4 г на 10 мл дистильованої води) і
пірофосфату заліза (0,25 г в 10 мл дистильованої води),
профильтрованные через мембранні фільтри з діаметром пор 0,45
мкн). pH середовища доводять до 6,9 при температурі 50 град. C
додаванням 1 н KOH або 1 н HCl. Середовище швидко розливають, злегка
збовтуючи для рівномірного розподілу активованого вугілля.
Розлиту середовище можна зберігати в чашках, поміщених у
пластикові або металеві контейнери протягом 2 тижнів.
Рыбокостная середовище готується так само, як і вугільно-дріжджова,
за винятком того, що в якості живильної основи замість
дріжджового екстракту використовується сірчанокислий гідролізат рибної
кормового борошна — 10 р. Кількість цистеїну, який додається в середу,
знижується до 0,2 р.
2. Біологічна проба
Біологічна проба є чутливим методом
виявлення легіонел в досліджуваному матеріалі. Для біологічної
проби використовують морських свинок вагою 250-300 г, які
хворіють і гинуть від легионеллезной інфекції при внутрішньоочеревинному
3 4
зараження суспензією, що містить 10 — 10 клітин бактерій. Через
12-48 годин у морських свинок виникає гарячкове захворювання з
підйомом температури до 39,5-41 град. З, прострацією і поразкою
очей. При масивному зараженні досліджуваного матеріалу морські
свинки гинуть на 3-4-ту добу; при меншій інфікованості
матеріалу загибель затягується до 5-8 діб. Термін спостереження за
тваринами до 10 днів.
У більшості випадків тварини гинуть від легіонельозу з
характерними патологічними змінами. При розтині
виявляється перитоніт з мізерним фібринозним ексудатом, різка
гіперемія парієтальної очеревини з ін’єкцією судин. Печінка і
селезінка збільшені з фібринозним нальотом на капсулі. В селезінці
зустрічаються дрібні вогнища некрозу. Найбільш характерним слід
вважати розвиток пневмонії без різко вираженого інфільтративного
запального процесу, некробіоз септальних клітинних
елементів, нерідко з некрозом альвеолярних перегородок і без
ураження крупних судин. Характерні також набухання і
десквамація мезотелия плеври.
В мазках-відбитках із селезінки та легенів при фарбуванні за
Романовському-Гімзе виявляють, як правило, значне
кількість легіонел, а при посіві на вугільно-дріжджовий агар
десятивідсоткової суспензії селезінки морських свинок в 0,05 М
фосфатному буфері (pH 7,0) через 48-72 години з’являється зростання
культури. Якщо у відбитках з органів присутня мала кількість
клітин збудника (<= 5 клітин у полі зору мікроскопа), то посів на середовища може бути негативним. В цьому випадку рекомендується ввести 10% суспензію селезінки морських свинок в жовткові мішки 5-6-денних курячих ембріонів в кількості 0,3-0,4 мл. Жовткові мішки курячих ембріонів, що загинули на 4-6-й день після зараження (на 1-3 добу ембріони гинуть від сторонньої мікрофлори), містять значну кількість збудника (50-100 клітин у полі зору мікроскопа), виявленої за забарвленням Романовському-Гімзе або прямий иммунофлюоресценцией.
3. Ідентифікація збудника
Попередню ідентифікацію здійснюють на легіонел
підставі морфології та забарвлення бактерій в мазках за Грамом.
Легіонели — грамнегативна паличка довжиною 2-3 мкм (іноді до 10
мк) специфічного світіння в реакції прямої імунофлюоресценції,
відсутній ріст на контрольних середовищах. Остаточна
ідентифікація в даний час можлива тільки в референс-центрі
НИИЭМ їм. Н.Ф.Гамалії (з допомогою біохімічних тестів,
газово-рідинної хромотографии і гібридизації ДНК).
МЕТОДИ ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКИ
1. Реакція прямої імунофлюоресценції
Метод прямої флюоресценції — найбільш поширений метод
для швидкого визначення легионеллезного антигену. Цей метод
володіє високою специфічністю і чутливістю.
Прямий імунофлюоресцентний метод дозволяє виявити
збудник L. pneumophila у відбитках зі свіжих і заморожених
шматочків легенів, у гістологічних зрізах, плевральному ексудаті,
мокротинні, матеріалі бронхоскопії, а також при ідентифікації
виділених культур.
Техніка приготування препаратів
На предметне скло наносять краплю досліджуваного матеріалу (або
роблять відбиток органів) і роблять тонкий мазок, так як у занадто
густому мазку не вдається відзначити світіння окремих клітин.
Препарат підсушують на повітрі при кімнатній температурі і
фіксують в ацетоні протягом 15 хвилин. Кордон досліджуваного
матеріалу, нанесеного на предметне скло, відзначають склографом
із зворотного боку препарату. Препарати зберігають при температурі +4
град. C до обробки люмінесцирующою сироваткою.
Техніка постановки реакції
На поверхню фіксованого і висушеного мазка, поміщеного
у вологу камеру (чашка Петрі з шматком змоченої в воді
фільтрувального паперу), наносять краплю «робочого розведення»
легионеллезной люмінесцирующою сироватки. Забарвлення препарату
виробляють 20 хвилин при температурі 37 град. C. Потім мазки
промивають 10-15 хвилин у фосфатному буфері pH 7,2, дистильованої
водою, висушують на повітрі, наносять гліцеринову середу,
покривають покривним склом і переглядають у люмінесцентному
мікроскопі.
«Робоче розведення» люмінесцирующою сироватки рекомендується
готувати у міру потреби.
Облік і оцінка результатів
Мазки микроскопируют в падаючому світлі люмінесцентного
мікроскопа ЛЮМАМ. Для мікроскопа використовують іммерсійне об’єктив
90x(1,25) і окуляри 5x7x і нефлюоресцирующее иммерсионное масло.
Для отримання яскравого світіння бактерій необхідно ретельно
центрувати освітлювальну систему мікроскопа і підбирати
відповідні світлофільтри. Наявність в препараті клітин бактерій
слід контролювати з допомогою фазово-контрастного пристрою.
У позитивних випадках після обробки даного препарату
специфічною легионеллезной люмінесцирующою сироваткою в
люмінесцентному мікроскопі виявляється специфічне
смарагдово-зелене світіння легионеллезных бактерій.
Ступінь яскравості люмінесценції бактерій, «забарвлених»
люминесцирующими антитілами, прийнято позначати в хрестах (див.
стор 14). Специфічним вважається світіння з яскравістю + + + + і +
+ +, з яскравістю світіння + + і + прийнято вважати неспецифічним.
Виявлення світиться ореолу хоча б у 3-5 клітин в кожному полі
зору свідчить про наявність у досліджуваному матеріалі бактерій.
Від’ємний результат свідчить про відсутність
мікроорганізму або про вміст у досліджуваному матеріалі в низькій
концентрації, яка виникає не иммунофлюоресцентным методом при
прямому дослідженні без підрощування або збагачення.
При дослідженні різних препаратів необхідно мати в
якості контролю мазок, приготований з 500 млн. суспензії
легионеллезных бактерій, оброблений люмінесцирующою сироваткою.
Незважаючи на те, що «робоче розведення» сироватки вказано на
етикетці ампули, для кожної сироватки його слід встановлювати
досвідченим шляхом, так як воно може мінятися в залежності від
конкретних умов мікроскопування препаратів.
З цією метою в ряді пробірок роблять кратні (1:2, 1:4, 1:8 і
тощо) розведення люмінесцирующою сироватки, використовуючи при цьому
фізіологічний розчин pH 7,2. Кожним розведенням сироватки
обробляють заздалегідь приготований, фіксований і підсушений
препарат з мазком з 500 млн. суспензії легионеллезных бактерій.
Подальша обробка препаратів йде за раніше описаною (для
прямого варіанта РИФ) методикою. «Робочим розведенням» сироватки
вважається те найбільше розведення, при якому виявляється
специфічне блискаюче зелено-жовте світіння бактеріальної
клітини на темному фоні препарату.
2. Реакція імуноферментного аналізу (ІФА) для
визначення антигену легионеллезного
Реакція імуноферментного аналізу (ІФА) дозволяє визначити
легионеллезный антиген у клінічному матеріалі (сеча, харкотиння,
бронхіальні змиви) за експериментальних і клінічних
дослідженнях.
Техніка приготування препаратів
В лунки полістиролів планшетів вносять по 100 мкл
легионеллезных імуноглобулінів у концентрації 20-30 мкг/мл в
карбонат-бикарбонатном буфері (КББ) pH 9,5. Планшети інкубують
при температурі 37 град. C протягом 2 годин або протягом 18
годин при температурі 4 град. C. Потім планшети тричі відмивають
ФСБ з 0,05% твіну-20, просушують. В лунки сенсибілізованих
планшетів вносять розведення досліджуваного матеріалу (антигену) в
об’ємі 100 мкл. Розведення антигену роблять на ФСБ з 0,05%
твіну-20. Інкубація 1 годину при температурі 37 град. C. Потім
планшети тричі відмивають за 5 хвилин ФСБ з 0,05% твіну-20. В лунки
відмитого планшета вносять кон’югат (легионеллезные імуноглобуліни
з ферментом пероксидази хрону). Кон’югат розводять тим же буфером з
твином-20 (робоче розведення кон’югату зазначено на етикетці).
Після 1-годинної інкубації при температурі 37 град. C лунки
планшета ретельно відмивають від непрореагировавшего кон’югату.
Потім в лунки планшета вносять по 100 мкл свіжоприготованого
субстрат-індикаторного розчину, що містить 0,04%
O-фенилендиамина в 0,1 М цитратно-фосфатному буфері pH 6,0, в
присутності 0,006% H2O2. Інкубують 30 хвилин у темряві при
кімнатній температурі. Реакцію зупиняють рівним об’ємом 1 н
розчину сірчаної кислоти.
Облік результатів
Реакцію враховують візуально або фотометрически по зміні
забарвлення субстрату в досвідчених лунках. Поява жовто-оранжевого
фарбування в лунках з антигенсодержащими пробами при його
відсутності негативних контрольних пробах свідчить про
позитивної реакції. При фотометричному обліку результатів при
492 нм проба вважається позитивною, якщо ВП досвіду в 2 рази і
більше перевищує ВП контролю. В якості негативних контролів
обов’язкові контроль субстрату і контроль сорбції кон’югату.
Специфічність аналізу підтверджується реакцією гальмування,
надлишком легионеллезных антитіл і реакцією з гетерологичными
антигенами грамнегативних бактерій.
4. ПРОФІЛАКТИЧНІ ЗАХОДИ
В даний час відсутні дані, що підтверджують
контагіозність легіонельозу, тому ізоляція і санітарна
обробка осіб, що перебувають у контакті з хворими, і медичного
персоналу не представляється доцільною.
При розробці заходів неспецифічної профілактики особливе
значення набувають особливості екології збудника: його
здатність до розмноженню у воді і розповсюдження з водним
аерозолем.
Легіонели є природними мешканцями прісноводних
ів. Симбіотичні взаємодії з деякими бактеріями,
синьо-зеленими водоростями, а також здатність до легіонел
внутрішньоклітинного паразитизму в найпростіших (амеби, джгутикові)
визначають розмноження легіонел у водоймах, що розрізняються по
температурі, рН, вмісту органічних та неорганічних
з’єднань, а також у ґрунтах.
Високі адаптивні здібності легіонел дозволяють бактеріям
успішно колонизовать штучні водні резервуари:
кондиціонери, зволожувачі, охолоджуючі башти градирні,
компресорні пристрої, системи водопровідної води, душові
установки, плавальні басейни, ванни для бальнеопроцедур,
медичне обладнання та інструменти та ін
Умови для виживання легіонел в штучних спорудах
виявляються більш сприятливими, ніж у природних, що призводить
до накопичення збудника в значних концентраціях і реальної
можливості попадання в організм людини.
Для розвитку легіонельозу необхідно попадання
дрібнодисперсного аерозолю, що містить легіонели, в легені
людини. Величина заражаючої дози не встановлена, однак
відомо, що зараження здорових людей відбувається при концентрації
4
легіонел у воді більше 10 КУО/л. У цьому зв’язку профілактичні
заходи повинні бути спрямовані на зниження концентрації
збудника легіонельозу в водних системах. Основними способами
контролю вмісту легіонел у водних резервуарах є
термічний і хімічний.
При першому способі здійснюють нагрів води, контаминированной
значною кількістю збудника, до температури не менше 80
град. C протягом доби. Цей момент знайшов застосування при
обробці систем опалення, водопровідної води, замкнутих систем
циркулюючої води.
При хімічному контролі найбільше поширення отримали
з’єднання-донатори активного хлору. Для дезінфекції доцільно
використовувати з’єднання, що забезпечують концентрацію залишкового
хлору 1-3 мг/л. При необхідності скорочення часу хлорування
концентрацію активного хлору слід збільшувати до 20-50 мг/л.
Для знезараження промислових або побутових водних резервуарів,
градирень, ставків-відстійників, систем оборотного водопостачання
рекомендується наступна схема. Після проведення постійного
хлорування, при концентрації 2-3 мг/л вільного хлору протягом
24-48 годин переходять на хлорування меншими дозами 0,7-1,0 мг/л
по 1 годині на добу. Для підтвердження ефективності
знезаражувальних заходів слід проводити бактеріологічне
дослідження проб води з визначенням концентрації легіонел.
Необхідно відзначити, що убиквитарность легіонел не дозволяє
добитися повного видалення бактерій з експлуатованих водних
систем або виключити їх повторне зараження. Тому заходи
епідеміологічного нагляду повинні зводитися до підтримання
3
допустимого рівня концентрації збудника (не більше 10 КУО/л),
не приводить до епідемічного легионеллезу.
На промислових підприємствах, атомних і теплових
електростанціях, в лікарнях і готелях при наявності систем
оборотного водопостачання, які використовуються в технологічних процесах
для кондиціонування або охолодження, необхідно не менше 2 разів на
рік проводити чистку і промивку систем. При виявленні в системах
легіонел необхідно щоквартально проводити вищеописані
дезінфекційні заходи з подальшим обов’язковим
бактеріологічним дослідженням проб води.
Додаток N 1
ЗБІР І ТРАНСПОРТУВАННЯ МАТЕРІАЛУ ВІД ХВОРИХ
ЛЕГІОНЕЛЬОЗУ
1. Збір сироваток.
Для отримання сироватки у хворих беруть в стерильні пробірки
кров з вени в кількості 3-5 мл в перші дні і на 14-21-й день
хвороби (не раніше 10-го дня). Після згортання крові згусток
відшаровують від скла стерильної пастерівської піпеткою і поміщають
на 12-16 годин при температурі +4 град. C або кімнатної
температурі. Відокремлену сироватку відсмоктують у стерильну
пробірку або в ампули запаюють і зберігають при температурі + 4 град.
C.
2. Сечу хворих на 3-7-й день хвороби в кількості 3-5 мл
збирають у стерильну пробірку, щільно закриті гумовою пробкою,
і поміщають для короткочасного зберігання при температурі +4 град.
C. Для тривалого зберігання матеріал заморожують.
3. Плевральний ексудат, матеріал бронхоскопії, отриманий
стерильно до 10-го дня хвороби у кількості від 0,5 до 5 мл,
поміщають в стерильну пробірку, щільно закриті гумовою пробкою,
і зберігають при температурі +4 град. C.
4. При зборі секційного матеріалу зразки уражених ділянок
легеневої тканини, печінки і селезінки (по 2-3 шматочки розміром 1×1
см) вирізують обробленими 70% спиртом і пропаленими в полум’я
спиртівки інструментами, поміщають у стерильні пробірки або
флакони, щільно закривають гумовими пробками.
Поверхня пробірок і флаконів обробляють дезінфікуючим
розчином (70% спирт, 1% формалін, 2% хлорамін). Транспортування
матеріалів здійснюють у жерстяних коробках з кришками або у
металевих біксах в можливо короткі терміни. Для
короткочасного зберігання матеріал поміщають при температурі +4
град. C. Тривале зберігання матеріалу (до 1 року) можливо лише
при температурі -70 град. C.
5. Матеріали від хворих з підозрою на легіонельоз і
неідентифіковані легионеллезные штами можуть бути спрямовані в
НИИЭМ їм. Н.Ф.Гамалії АМН СРСР для підтвердження діагнозу за
наступною адресою: 123098, Москва, вул. Гамалії, 18,
Науково-дослідний інститут епідеміології та мікробіології
їм. Н.Ф.Гамалії АМН СРСР.
Додаток N 2
ВІДБІР І ТРАНСПОРТУВАННЯ ЗРАЗКІВ ЗОВНІШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА
1. Відбір проб
Для дослідження проби води беруть з різноманітних
природних і штучних водойм: річок, струмків, озер, ставків,
боліт, меліоративних каналів, стічних вод, термальних ів,
а також із систем водопостачання гарячою і холодною водою, водних
систем охолодження, ємностей для зберігання води.
З однієї точки необхідно брати по 2 і більше проби. Воду в
кількості 500 мл відбирають в стерильні бутлі, закривають пробкою
з паперовою прокладкою або гумовою пробкою, закривають паперовим
ковпачком та обв’язують шпагатом. При великій кількості зразків
щоб уникнути труднощів, пов’язаних з транспортуванням, обсяг
зразків води може бути зменшений до 100 мл Бутлі з водою
поміщають у поліетиленові або поліетиленові мішки і упаковують в
ящик для доставки в лабораторію.
Для дослідження беруть змиви з внутрішньої поверхні
кондиціонерів, санітарно-технічного і лікарняного обладнання,
водопровідних кранів, головки душа, шлангів замкнутих водних
систем охолодження, ємностей для зберігання води, медичних і
побутових приладів, пов’язаних з розпиленням або розбризкуванням, а
також з відкритих поверхонь у будівлях або в інших місцях
передбачуваних спалахів або спорадичних випадків легіонельозу.
Відбір проб проводять з допомогою стерильних ватних тампонів.
Тампоном, зволоженим стерильним фізіологічним розчином,
проводять по поверхні і поміщають в стерильну пробірку,
містить 5 мл фізіологічного розчину. Крім фізіологічного
розчину для змивів можна використовувати воду з аналізованої
системи водопостачання, попередньо профільтровану через
фільтри з діаметром пор 0,45 мкм.
2. Умови зберігання і транспортування
Збудник добре зберігається у водному середовищі. Зразки води,
3
містять збудник в концентрації 10 клітин на літр, можуть
зберігатися протягом 3 місяців при температурі 20-25 град. C. Змиви
з поверхні можуть зберігатися при тих же умовах протягом 30
днів. Короткочасні температурні зміни при транспортуванні
зразків в діапазоні від +4 град. до +30 град. З не впливають на
збереження зразків.
Для подальших досліджень зразки концентрують. Зразок
може бути сконцентрований безпосередньо після відбору проб або
після доставки в лабораторію на дослідження. Попередня
концентрація спрощує доставку зразків для лабораторних
досліджень. Концентровані зразки також можна зберігати в
протягом 30 днів при температурі +4 град. C.
3. Концентрація зразків
Для концентрації зразків застосовують центрифугування або
фільтрацію: зразки попередньо фільтрують через 2-шарову марлю
для звільнення від великих часток, після чого воду центрифугують
20 хвилин при 7-8 тис. об/хв. Осад ресуспендують у 5 мл
стерильного фізіологічного розчину або в тому ж обсязі
аналізованої води, попередньо профільтрованої через фільтр з
діаметром пор 0,45 мкм. Для концентрації змивів і зразків води
об’ємом менше 20-30 мл може бути використана фільтрація через
фільтри діаметром пор 0,22 – 0,3 мкм. Фільтри зберігаються в пробірках
з 2-3 мл води досліджуваного зразка.
Додаток N 3
1. Приготування фосфатно-сольового буфера (ФСБ).
40 мл основного розчину (27,4 г/л NaH2PO4, 7,87 г/л Na2HPO4)
змішують з 8,5 м NaCl, додають дистильованої води до 1 л,
перевіряють pH, яка повинна бути 7,2, стерилізують при температурі
120 град. C протягом 20 хвилин.
2. Приготування 0,5% середовища яєчного жовтка.
Беруть стерильною піпеткою 10 мл вмісту жовткового мішка
свіжого курячого яйця і суспендують їх в 100 мл фосфатного
буфера, додають 0,05% азиду натрію, отриманий 10% розчин
зберігають при температурі +4 град. C.
Для приготування робочого 0,5% розчину 10% розчин розводять
фосфатним буфером рн 7,2 в 20 разів.
3. Середа з гліцерином.
Беруть 9 частин гліцерину і 1 частина фосфатно-буферного розчину
pH 8,5. Фосфатно-буферний розчин роблять шляхом з’єднання 10
частин розчину N 1 і 1 частини розчину N 2. Розчин N 1 роблять
шляхом з’єднання K2HPO4 — 1,161 р, NaCl — 0,85 м і H2O — 100 мл
Розчин N 2 роблять шляхом з’єднання KH2PO — 0,907 р, NaCl — 0,85 г
і H2O — 100 мл
4. Карбонат-бікарбонатний буфер 0,05 моль/л pH 9,5 (буфер
приєднання).
Буфер роблять шляхом з’єднання NaHCO3 — 0,24 г, Na2CO3 — 0,7 г
і 200 мл H2O.
5. Буфер цитратный 0,1 моль/л, pH 5,5 (буфер для субстрату).
Буфер роблять шляхом з’єднання лимонної кислоти — 0,234 р,
Na2HPO4 x 12H2O — 0,9 м, Н2О — 62,5 мл
Безпосередньо перед використанням, після розчинення
додати 0,3 мл 3% перекису водню.
www.lawrussia.ru
