Генетика бронхіальної астми

Роль генів інтерлейкінів та їх рецепторів у формуванні схильності до бронхіальної астми і атопії

Імунна відповідь при БА та/або атопії починається з взаємодії алергену з дендритными клітинами слизової дихальних шляхів. Взаємодія за допомогою молекул класу II головного комплексу гістосумісності CD1a+ дендроцитов з рецепторами Т-клітин стимулює диференціацію T_h0-лімфоцитів у T_h2-клітини, здатні до секреції інтерлейкіну 10 (Іл-10) цитокінів, чиї гени розташовані на хромосомі 5q: Іл-3, -4, -5, -9, -13, GM-CSF, а функція тісно пов’язана з гуморальною відповіддю. При дії антигенів мікобактерій та деяких вірусів CD4+ клітини перетворюються в T_h1-клітини, що секретують Іл-2, інтерферон-g (Іфн-g ) і лимфотоксин-? (фактор некрозу пухлин-?). Поляризація у бік T_h2-відповіді активується Іл-4 і інгібується Іфн-g -a . T_h1-відповідь вимагає вивільнення Іл-12 макрофагами і дендритными клітинами і супрессируется Іл-10 (цит. за: Holgate, 1997).

T_h2-клітини вивільняють прозапальні цитокіни, головним чином Іл-4 та -13, які, взаємодіючи зі своїми рецепторами на В-клітинах, активують транскрипцію генного локусу важкої ланцюга типу e імуноглобулінів і разом з сигналом, що передаються молекулою CD40 В-клітин, індукують перемикання изотипов з m e (Stavnezer J., 1996).

IgE, высвобождаемый активованими В-клітинами, зв’язується з високо-афінного (Fce R1) і низько-афінного (Fce R2; CD23) рецепторами мастоцитів. Коли алерген взаємодіє з IgE на мастоцитах, Fce R1 ініціює серію внутрішньоклітинних подій, що призводять до вивільнення медіаторів запалення та хемокінів: гістаміну, простагландинів, лейкотрієнів, фактора активації тромбоцитів, дегранулированных протеаз, эотаксина та ін. (Galli S. J., 1993). Крім того, ці медіатори синтезуються еозинофілами, активованими Іл-3, -5, GM-CSF і ін. (Gleich, Kita, 1997; Holgate, 1997). Діючи в сукупності всі ці фактори призводять до микроизменениям судин стінок повітроносних шляхів, скороченням гладкої мускулатури бронхів, гіперсекреції слизу. Крім того, цито – і хемокіни, принаймні, частково відповідальні за міграцію та активацію клітин запалення і, таким чином, вносять внесок у збереження патологічного процесу (Ricci M. et al., 1997).

Наведена схема розвитку запалення при БА далеко не вичерпна. Проте вона цілком прийнятна з точки зору пошуку генетичної основи БА, оскільки містить всі ключові ланки патогенетичного каскаду захворювання. Враховуючи значне число агентів, що беруть участь у розвитку запалення, а також вплив негенетических факторів (наявність у середовищі алергенів, вік, кліматичні особливості тощо) на розвиток БА, правомірною буде гіпотеза про мультифакторіальної природи захворювання. Ця обставина сильно ускладнює генетичний аналіз БА. До теперішнього часу ідентифіковано понад 20 генів-кандидатів БА і атопії (Пузирьов В. П. та ін, 1998; табл.). Список цей аж ніяк не повний і постійно розширюється.

Гени-кандидати бронхіальної астми та атопії

(Пузирьов та ін, 1998; з доповненнями і змінами)

Примітка. Підкреслені і виділені курсивом гени, для яких відомі поліморфізми, асоційовані з астмою. У рамку виділені гени, для яких асоціацію з астмою, загалом, не показано, але які за непрямими причин розглядають як кандидати

В даний час реалізовано три підходи до вивчення генетики БА і атопії. Перший з них включає використання кандидатных генів в аналізі зчеплення або асоціації в сім’ях з хворими БА або популяціях для встановлення участі цих генів у патогенезі захворювання (Meyers D. A. et al., 1994; Postma D. S. et al., 1995; та ін). Велика частина досліджень виконана на основі саме цього підходу.

У рамках другого підходу використовують микросателлитные ДНК маркери для сканування всього геному на зчеплення з БА в популяціях. Відомі чотири таких дослідження (Daniels S. E. et al., 1996; The Collaborative Study…, 1997; Koppelman G. H. et al., 1998; Ober C. et al., 1998). Загальна мета цього типу позиційного клонування — ідентифікувати раніше не відкриті гени, які можуть бути асоційовані з захворюванням. Ці дослідження виявили принаймні 15-20 локусів, асоційованих з БА та/або атопією. В деяких випадках, можливо, це хибно-позитивні результати (Rosenvasser L. J., 1997). Як би те ні було, повно-геномний скринінг дозволив виявити ряд важливих обставин. По-перше, переконливо показано, що розвиток астматичного синдрому включено безліч генів різних локусів, кожен з яких може вносити невеликий внесок у спільну генетичну базу захворювання. По-друге, з’явилися дані, що свідчать про те, що відносна специфічна важливість генів схильності до астми і ефектів навколишнього середовища або генів-модифікаторів може варіювати в залежності від етнічного фону (The Collaborative Study…, 1997). Нарешті, отримала непряме підтвердження гіпотеза про різних молекулярних засади БА і атопії (The Collaborative Study…, 1997; Koppelman et al., 1998; Ober et al., 1998).

Третій тип досліджень генетики астми спрямований на ідентифікацію асоціацій захворювання з полиморфизмами ДНК кандидатных генів або їх білкових продуктів. Такі дослідження проведені для Іл-4 і його рецептора, Іл-9, b -ланцюга високо-афінного рецептора IgE (Fce R1b ), b ₂-адренергічного рецептора, факторів некрозу пухлин a і b і деяких інших кандидатів (Hill M. R. et al., 1996; Mao H.-Q. et al., 1996; Hershey G. K. K. et al., 1997; Mitsuyasu H. et al., 1998; та ін).

Дослідження генетичних основ БА цілком укладаються в схему сучасної парадигми вивчення мультифакторіальних захворювань (МФЗ) (Пузирьов, Степанов, 1997). Згідно з цією схемою, на першому етапі з допомогою аналізу генетичного зчеплення і асоціацій виробляють локалізацію генів схильності до МФЗ. Потім за допомогою позиційного та/або кандидатного підходу локалізовані до певного регіону гени можуть бути ідентифіковані. Після цього необхідний пошук мінливості в кандидатном гені і з’ясування її точної природи. Тут нагальною стає завдання диференціації нейтрального і патологічно значного поліморфізму. Як раз на цьому етапі зараз, мабуть, і знаходяться більшість дослідників генетики БА і атопії. Після визначення патогномоничности тих чи інших мутацій кандидатных генів МФЗ можливе створення модельних систем для з’ясування деталей ефектів окремих локусів незалежно від інших генів і факторів середовища. В генетиці БА широко використовують з цією метою мишачі моделі (Gleich, Kita, 1997). Нарешті, отримані результати можуть бути використані в цілях діагностики і, можливо, генотерапії МФЗ, а також для прояснення ефектів взаємодії генетичних і середовищних факторів.

Серед великого числа генів-кандидатів БА і атопії увагу дослідників у великій мірі залучені до гена Іл-4. Іл-4 часто називають критичним цитокіном запалення (Hershey et al., 1997). Саме Іл-4 на початкових стадіях розвитку запалення, зв’язуючись зі своїм рецептором на поверхні В-клітин, змінює їх на виробництво IgE. Подібною здатністю володіє також Іл-13, але його активність приблизно в 5 разів нижче (Paul W. E. et al., 1994). Ще однією функцією Іл-4 є активація експресії високо-афінного рецептора до IgE на CD23+ В-клітинах. Іл-4 також індукує ендотеліальні клітини на виробництво молекул адгезії, що призводить до селективної акумуляції еозинофілів у вогнищі запалення. Нарешті, Іл-4 є сигналом диференціації Т-клітин CD4+ хелпери 2 типу, які потім вивільняють додаткову кількість Іл-4 (Paul et al., 1994).

Внаслідок центральної ролі Іл-4 у розвитку запалення, аналіз генетичної регуляції активності цього цитокіна, має дуже велике значення для розуміння механізмів розвитку атопії та БА (Rosenvasser, 1997).

Іл-4 представляє собою глікопротеїн, що складається з 153 амінокислотних залишків не рахуючи сигнального пептиду. Молекулярна маса її близько 18 килодальтон. Крім описаних вище активностей, Іл-4 також виступає як фактор росту Т-клітин і мастоцитів (Yokota et al., 1986). Ген Іл-4 розташований в районі 5q31.1, має протяжність близько 10 килобаз і містить 4 екзона (Arai N. et al., 1989).

Незважаючи на привабливу роль Іл-4 в якості причинного фактора в розвитку атопії, дані на цей рахунок досить суперечливі. Ряд досліджень підтвердили зчеплення астми та/або атопії з ділянкою 5q31.1 (Marsh D. J. et al., 1994; Meyers et al., 1994; Postma et al., 1995), проте, є і негативні результати (Venugopal G. et al., 1995; Daniels et al., 1996; Laitinen T. et al., 1997).

В одному з досліджень було знайдено поліморфізм (транзиція С Т у позиції 590) промоторной області гена Іл-4, асоційований (хоча і слабо) з БА і підвищеною концентрацією сироваткового IgE (Borish L. et al., 1994). Частота алелю у астматиків у цьому дослідженні склала 37 %. В іншому дослідженні хворі БА мали більш низьку частоту поліморфізму, близько 33 % (Walley A. J. et al., 1996). Там же була показана слабка асоціація цього поліморфізму з підвищенням рівня загального сироваткового IgE у відповідь на антигени кліща домашнього пилу (р=0,013) і сопінням (р=0,029). Цікаво, що ці асоціації були виявлені тільки у вибірці жителів Австралії (n=1004), але не Британії (n=183), що ще раз підтверджує важливість етнічного компонента у розвитку БА. Ці дані надають лише дуже слабкі докази участі поліморфізму С590Т у формуванні схильності до атопії та БА.

Іл-4 функціонує через свій рецептор (Il4R) на клітинах-мішенях, який, у свою чергу, діє через активацію Stat-6 (signal transducer and activator of transcription, фактор транскрипції, медиирующий індукцію експресії генів сигналом інтерлейкіну-4) (Hou J., et al., 1994). Показано, що миші, дефектні по Stat-6 або Il4R, не виробляють IgE та не формують Т_h2-запальної відповіді (цит. за: Mitsuyasu et al., 1998).

Рецептор до Іл-4 складається з двох субодиниць: 140 к. д. a — специфічної для цього ефектора, і ? — загальною для інших рецепторів цитокінів (Hou et al., 1994). Використовуючи SSCP-аналіз і секвенування ДНК Hershey et al. (1997) виявили мутацію в гені a -ланцюга рецептора Il4R, розташованого на хромосомі 16р12.1-р11.2. В результаті заміни залишка гуаніна на аденін у позиції 1902 зазначеного гена, відбувається заміщення глутаминоваго залишку на аргининовый в позиції 576 a -ланцюга рецептора (Q576R) (Hershey et al., 1997). Автори вивчили вплив цієї заміни на прояви атопії. Для аналізу були використані три пацієнта з синдромом гиперпроизводства IgE і сім пацієнтів з атопічним дерматитом. Крім того, було досліджено 50 осіб, 20 з атопією і 30 здорових. Всі пацієнти з синдромом гиперпроизводства IgE були гетерозиготны за аллелю R576. Серед пацієнтів з атопічним дерматитом 3 були гетерозиготны, а один гомозиготен за вказаною аллелю. Серед 50 неспоріднених індивідів R576 була асоційована з відносним ризиком атопії дорівнює 9,3 (значення статистики точного критерію Фішера для таблиць спряженості; р=0,001). Загальна частота алелю у вибірці (100 хромосом) склала 20 % (35 % серед атопиков і 10 % серед неатопиков, р=0,04). Сукупність цих даних свідчать про істотну асоціації R576 з атопією. Оскільки більшість суб’єктів, які несуть хоча б одну копію мутантного алелю, мали ознаки атопії, був предположен домінантний ефект алелю. Проте деякі суб’єкти, гетерозиготні або гомозиготні за R576 були здорові, що свідчить про модифікації пенетрантності алелю іншими факторами (Hershey et al., 1997).

Дані Hershey et al. Нещодавно були підтверджені C. N. Yandava et al. (1998). Ця група дослідників протипировала за R576 128 білих нормальних індивідів і 138 астматиків і знайшли достовірно більш високу частоту алеля R576 у хворих порівняно з контролем (p<0,005). Також була підтверджена асоціація високого рівня IgE з цією мутацією в контрольній групі (p<0,001).

Для з’ясування молекулярних основ зазначеної асоціації Hershey et al. (1997) досліджували сигнальну функцію мутантного (R576) і дикого типу алелей Il4Ra . Було показано, що Іл-4 індукує підвищений рівень експресії CD23 мононуклеарних клітин крові гомо – або гетерозигот за R576, порівняно з таким у індивідів, які не мають мутантний алель. Причому, підвищена експресія CD23 була відзначена не тільки у пацієнтів з атопією, але і у здорових людей з R576. Таким чином, було показано, що сигнальна функція R576 вище, ніж у алелі дикого типу (Hershey et al., 1997).

Рецептор Il4Ra безпосередньо взаємодіє з молекулярною ефекторів у позиції 575, де знаходиться залишок тирозину (Y575). Тому було висловлено припущення, що заміна Q576R може впливати на взаємодію фосфорильованого Y575 c сигнальним посередником. Було зосереджено увагу на впливі мутації на зв’язування Y575 з Stat-6 і SHP-1 (фосфотирозинфосфатаза, що включає сигнал термінації транскрипції генів за допомогою рецепторів цитокінів, у тому числі і Іл-4). Було показано, що ступінь зв’язування Stat-6 з Il4Ra схожий як для мутантного, так і для дикого типу алелей. У той же час, SHP-1 приблизно в два рази краще зв’язується з рецептором дикого типу, але не з мутантним. Причому специфічність зв’язування SHP-1 саме з Y575 була підтверджена пробами з рекомбінантними фрагментами SHP-1. Зниження ступеня зв’язування SHP-1 з Y575 може мати відношення до зміни сигнальної функції продукту мутантного алелю (Hershey et al., 1997).

Таким чином, можлива схема розвитку атопії допомогою Il4Ra виглядає так: мутація R576 зменшує здатність Y575 до взаємодії з SHP-1, що знижує ступінь зв’язування SHP-1 з рецептором, а це призводить до зниження функції термінації експресії генів, результатом чого є гіперпродукція Іл-4.

Важлива роль мутацій гена Il4Ra в патогенезі атопії підтверджена й іншими даними. Нещодавно був ідентифікований Ile50Val варіант Il4Ra , єдиний знайдений до теперішнього моменту экстраклеточный варіант рецептора у людини (цит. за: Mitsuyasu et al., 1998). На великій вибірці японців (n=120-240) показано, що, по-перше, частота гетерозигот Ile/Val 50 у астматиків достовірно нижче, ніж у здорових індивідів, по-друге, варіант Ile50 асоційований з атопічною астмою, але не з атопією в цілому, по-третє, Ile50 специфічно і достовірно асоційований з підвищенням рівня загального сироваткового IgE та IgE, специфічного до антигенів кліща домашнього пилу. Крім того, була відзначена висока частота (близько 60 %) гомозигот Ile/Ile 50 в групі дітей з атопічною астмою при достовірному зміщенні від рівноваги Харді-Вайнберга (p<10^-4), що свідчить про рецесивному ефекті алелю Ile50 (Mitsuyasu et al., 1998). Ile50 варіант Il4Ra значно (приблизно в три рази порівняно з Val50) підвищує активність Іл-4-відповіді, причому не за рахунок гиперпроизводства Il4Ra , а за рахунок підвищення активності субодиниці рецептора. Крім цього, Ile50 в 1,8 рази підвищує активацію Stat-6 порівняно з Val50 (Mitsuyasu et al., 1998).

За аналогією з вищеописаною схемою можна припустити, що Ile 50 варіант Il4Ra істотним чином модифікує відповідь на зв’язування з Іл-4, що призводить до підвищеної активації Stat-6. Це в свою чергу збільшує проліферативну активність клітин і підвищену продукцію IgE (Mitsuyasu et al., 1998). Крім того, ці два механізми (зниження активності SHP-1 і підвищення активності Stat-6) можуть діяти в синергізмі.

Однак T. D. Howard et al. (1998) на великій вибірці голландців (141 сім’я) не змогли виявити асоціацій мутації R576 (Arg576Gln) ні з BHR, ні з підвищеним рівнем IgE, ні з позитивним шкірним тестом на алергени. Можливо, мутації Il4Ra (Ile50Val і Arg576Gln) можуть лише косегрегировать з мутаціями інших молекул, які зумовлюють розвиток БА і атопії. Необхідні дослідження інших генів, що беруть участь у сигнальному шляху Іл-4, включаючи протеинкиназу Януса (Jak) і Stat-6. Також як і раніше представляють інтерес і дослідження поліморфізму гена самого Іл-4 (Hershey et al., 1997; Rosenvasser, 1997).

Як би те ні було, ген Il4Ra (16р12.1-р11.2) залишається, мабуть, одним з головних кандидатных локусів БА і атопії. Дослідження вже відомих його поліморфізмів у зв’язку з БА і атопією, а також пошук нових мутацій цього гена представляє великий інтерес.

Іл-4 аж ніяк не єдиний цитокін, який бере участь в розвитку запалення при БА. Серед інших, подібних йому молекул, інтерес дослідників притягнуто до Іл-5. На мишачих моделях захворювання показано, що деякі типи T_h2-відповіді можуть мати місце і в Іл-4^-/--мишей (Webb L. M. C. et al., 1997; Hogan S. P. et al., 1997). Більше того, у таких мишей обструкція дихальних шляхів і ступінь BHR знижені лише в дуже малому ступені. У відповідь на овальбумин CD4+ Т клітини у нормальних і Іл-4^-/--мишей продукували високий рівень Іл-5. При дії на Іл-4^-/- мишей анти-Іл-5-антитіл незадовго до дії алергену у тварин помітно знижувався рівень еозинофілії, пошкодження легенів і BHR (Hogan et al., 1997). Більш того, у мишей з браком B-клітин в легенях і дихальних шляхах розвивається алергічне запалення з участю еозинофілів. У теж час, Іл-5^-/--миші повністю позбавлені від еозинофілії, бронхолегеневої обструкції і BHR (Hogan et al., 1997).

Іл-5, сам по собі відносно слабкий хемоаттрактант, однак, він ефективно і специфічно направляє еозинофіли на розширення хемотактической чутливості і пролонгування їх виживання в тканинах-мішенях, блокуючи апоптоз. Еозинофіли ж, у свою чергу, відомі, як прозапальні гранулоцити, які відіграють основну роль у розвитку багатьох алергічних захворюваннях, у тому числі БА, алергійного риніту, атопічного дерматиту та ін. (Ricci et al., 1997). Описані позитивні кореляції між ступенем еозинофілії та тяжкістю перебігу БА (Kita et al., 1996).

Таким чином, Іл-5 необхідний для індукції запалення з участю еозинофілів, що призводить до обструкції і гіперреактивності дихальних шляхів. Іл-5, мабуть, має більше відношення до клінічних проявів БА, в той час, як Іл-4 — до сверхпродукции IgE, тобто, до атопії (Cogan E. et al., 1994). Це підтверджується і даними, що неалергічних астматиків накопичується Іл-5, Іл-2 та Іфн-?, але не Іл-4 (цит. за: Ricci et al., 1997). Якщо це припущення підтвердиться, то це може послужити основою для клінічної діагностики різних типів БА.

В даний час в доступній нам літературі дані, що стосуються асоціацій поліморфних варіантів гена Іл-5 з БА і атопією, виявлені не були. Однак є непрямі свідчення про асоціацію гена ?-ланцюга рецептора до цього цитокину на клітинах-мішенях з БА і атопією. Цей ген (IL5RA) картирован в районі 3p26-p24 (Isobe M. et al., 1992). У той же час, Ober et al. (1998) в полногеномном пошуку генів схильності до БА і атопії в популяції гаттеритов (N=361) виявили асоціацію клінічних ознак захворювання з локусом 3p24.2-22. Koppelman et al. (1998) також виявили шанси на зчеплення BHR з локусом на хромосомі 3 (LOD=2,3). За аналогією з даними, отриманими для гена рецептора до Іл-4 можна припустити важливу роль поліморфізму гена рецептора до Іл-5 в розвитку БА і атопії.

Крім Іл-4 та Іл-5 важливе місце в патогенезі БА і атопії займає Іл-9. Цей цитокін, званий також чинником зростання Р40 Т-клітин і мастоцитів, є регулятором активності мієлоїдної та лімфоїдної систем (Holdbrook S. T. et al., 1991). Показана кореляція продукції Іл-9 с Т_h2-відповіддю і вивільненням IgE (цит. за: Nicolaides N. C. et al., 1997). Для Іл-9 отримані цікаві дані, що стосуються генетичної компоненти БА. Ген Іл-9, довжиною близько 4 килобаз, локалізована в районі 5q31.1, ближче до теломерному кінця хромосоми по відношенню до кластеру інших інтерлейкінів і складається з 5 екзонів (Le Beau M. M. et al., 1993).

В одному з досліджень поліморфізму гена Іл-9 була протипирована 131 британська сім’я, однак зчеплення ні з BHR, ні з рівнем IgE виявлено не було. Тим не менш, один з алелів Іл-9 виявив суттєву асоціацію з лог-рівнем сироваткового IgE (цит. за: Laitinen et al., 1997).

В іншому дослідженні було знайдено варіант Іл-9, пов’язаний із заміною С Т у позиції 338 екзона 5 (Laitinen et al., 1997). Ця заміна зумовлює появу нового сайту для рестриктази NcoI, що надає відмінний засіб для швидкого типування великих популяцій. Даний поліморфний варіант був зустрінутий у 15 % хромосом (80/542) і не показав значущою асоціації з підвищеним рівнем IgE (38/253) або астмою (43/323). Автори припустили, що відсутність зв’язку зумовлено малою кількістю хворих у дослідженні.

Більш обнадійливі результати про зв’язок гена Іл-9 з БА були отримані при аналізі мишачої моделі захворювання. Так, було показано, що миші з бронхіальною гипочувствительностью експресують помітно нижча кількість Іл-9 в легенях порівняно з гіперчутливими, в той час, як у їх гібридів відзначені проміжні значення Іл-9 на тлі проміжного значення ступеня чутливості бронхів (Nicolaides et al., 1997). Причому, гени, локалізовані поруч з геном Іл-9, не показали ніяких відмінностей в експресії. Таким чином, генетичні зміни, асоційовані з диференціальної експресією Іл-9 у досліджених мишей, специфічні для цього локусу.

Цінним може виявитися і вивчення зв’язку з БА і атопією гена рецептора Іл-9 (IL9R). Цей ген ідентифікований та клоновано. Він локалізований у псевдоаутосомальном регіоні Xq28 і Yq, складається з 11 екзонів і займає близько 17 кб. Були також знайдені псевдогены IL9R в районах 9q34, 10p15, 16p13.3 і 18 11.3 (Kermouni A. et al., 1995). Причому, показано, що ген IL9R експресується з Y-хромосоми і уникає X-інактивації (Vermeesch J. R., et al., 1997). Отримані дані про зчепленні астми, BHR і рівня загального IgE з інформативним маркером DXYS154, що знаходяться у вказаному псевдоаутосомальном регіоні, що підтримує припущення про кандидатной ролі гена рецептора Іл-9 у розвитку астми (Holroyd K., et al., 1998).