В. Н. Сєров, С. Р. Цахилова, П. Д. Бонарцев, А. М. Абубакирова, Т. А. Федорова, Н.В. Орджонікідзе, Т. Р. Хлистова, Е. М. Бакуридзе
Науковий центр акушерства, гінекології та перинатології РАМН
(директор центру — академік РАМН, проф. в. І. Кулаків), Москва.
Вісник Російської Асоціації Акушерів-Гінекологів № 1 ’98
В даний час відомий ряд хронічних захворювань піхви і шийки матки, що виникають у результаті інфікування статевих шляхів аденовірусами, цитомегаловірусом, Вірусом Коксакі A, ECHO і ін [15]. Але найчастіше геніталії уражаються вірусом простого герпесу (ВПГ). Ця інфекція становить значну проблему для репродуктивного здоров’я населення, так як первинне інфікування вірусом простого герпесу або рецидиви захворювання під час вагітності можуть призвести до внутрішньоутробної інфекції, що викликає ушкодження, після яких подальший розвиток плоду стає неможливим або супроводжується тяжкими ускладненнями, а інфікування під час пологів може бути причиною важких неонатальних і постнатальних захворювань новонароджених [12, 16, 19, 20].
Вірус герпесу відноситься до ДНК-вмісних вірусів, має складну структуру, віріони діаметром 150-200 нм містять протеїн, спермін, глік – і ліпопротеїди. Вірус чутливий до ефіру, фенолу, формалину, алкоголю, нагрівання до 55о С руйнує його протягом 30 хв [1].
Вірус починає розмножуватися в місці інокуляції, де з’являються типові бульбашкові висипання, і проникає в кров’яне русло. Встановлено, що вірус може осідати у вигляді елементарних тілець в еритроцитах, а також вражати лейкоцити, лімфоцити, макрофаги. Таким чином, вірусемія є однією з причин дисемінації вірусу в організмі, зумовлює інтенсивність клінічних проявів хвороби [1].
Виявлено два серотипу ВПГ: ВПГ-1 і ВПГ-2. По загальноприйнятій думці, ВПГ-2 відводиться етіологічна роль при генітальних, а ВПГ-1 — при екстрагенітальних вогнищах. Генітальний герпес — одне з найбільш поширених захворювань, що передаються статевим шляхом, займає друге місце після тріхомоноза [18]. Первинне інфікування статевої сфери відбувається переважно в період початку активного статевого життя у віці 18-25 років при контакті з партнером, що страждають генітальним герпесом. Другий пік захворюваності у жінок на відміну від чоловіків припадає на вік 45 років і старше [14]. Для генітального герпесу характерно тяжкий перебіг з частими рецидивами хвороби, що порушують нормальну статеву функцію пацієнта. Багато дослідників підкреслюють, що хвороба створює конфліктні ситуації в сім’ї, є ом нервово-емоційних порушень у хворого, здобуваючи соціальний характер. Припускають, що 50-60% осіб у групі з низьким рівнем життя мають антитіла до ВПГ-2 до середини життя, ці антитіла виявлені лише у 10-20% осіб у групі з високим рівнем життя і у 35% жінок середнього класу [20].
Клінічні прояви первинного герпесу зазвичай спостерігаються протягом 2-3 тижнів. Строки виникнення рецидиву варіюють, але у 50% хворих вони з’являються в найближчі 6 міс. При цьому симптоми виражені слабше і менш тривало, ніж при первинній інфекції (7-10 днів). При збільшенні тривалості захворювання та у зв’язку з проведеним лікуванням клінічна картина може змінюватися [19]. Характерним для патогенезу герпетичної хвороби є порушення імунної відповіді [6, 8, 13, 17]. У противірусному захисті організму беруть участь фактори клітинного і гуморального імунітету. Фактори клітинного імунітету беруть участь у пригніченні репродукції вірусу, в процесах міграції та стягнення макрофагів, лімфоцитів у вогнищі запалення. Крім того, фактори клітинного імунітету, з одного боку, викликають лізис інфікованих клітин і сприяють вивільненню внутрішньоклітинного вірусу для подальшої нейтралізації його антитілами, з іншого — впливають на сусідні нормальні клітини, попереджаючи їх інфікування [4, 17].
Лікування хворих з генітальним герпесом являє собою складну задачу. Воно повинно бути комплексним, спрямованим на придушення репродукції вірусу при одночасній стимуляції факторів специфічного та неспецифічного захисту організму. Одним з перспективних немедикаментозних методів лікування є фотогемотерапия, зокрема ендоваскулярне лазерне опромінення крові (ЭЛОК). Лікувальний ефект досягається за рахунок впливу лазерного випромінювання на формені елементи крові, білкові структури плазми, антиоксидантну систему. У результаті опромінення крові відзначається активізація ферментів в еритроцитах, покращення реологічних показників і зниження коагуляційних властивостей крові, відбуваються зміни в імунній системі, нормалізуються процеси перекисного окислення ліпідів, енергетичний баланс організму, зазначається бактерицидний ефект [7]. Все більше знаходить підтвердження концепція про єдиному потоці каскадних клітинних і ферментативних реакцій, що забезпечують взаємодію зазначених систем регулювання [10]. Електронна мікроскопія дає унікальну можливість вивчати одночасно функціональний стан елементів систем гемостазу, імунітету та неспецифічної резистентності, їх макромолекулярних комплексів, тобто проводити многотестовое дослідження компонентів крові на ультраструктурному (біохімічному рівні.
Метою цієї роботи було вивчення структурно-функціонального стану компонентів периферичної крові у жінок (поза вагітністю) з типовою формою генітального герпесу при проведенні ендоваскулярної лазерної терапії.
В досліджувану групу були включені 20 пацієнток у віці від 20 до 45 років з типовою формою генітального герпесу. Під наглядом гінеколога вони знаходилися протягом 5 років і більше. Контрольну групу склали 10 здорових жінок репродуктивного віку. Діагноз генітального герпесу підтверджений наявністю антигенів ВПГ, виявлених прямим методом флуоресцентних антитіл у зішкрябах епітелію вульви, піхви, шийки матки. Результати вважалися позитивними при дворазовому виявленні смарагдово-зеленого свічення ВПГ і специфічних герпес-вірусних включень в цитоплазмі епітеліальних клітин в досліджуваному матеріалі. Хворі скаржилися на епізодично з’являються типові герпетичні дрібнобульбашкові висипання різного діаметру, розташовані групами або поодиноко на малих статевих губах, слизовій оболонці піхви або шийки матки. Пацієнтки відзначали загальне нездужання, головний біль, виражене збільшення лімфатичних вузлів, знижену працездатність. Хворих турбували виснажливий свербіж і печіння в області зовнішніх статевих органів, що не піддаються якому-небудь лікування, що значною мірою було перешкодою для статевого життя, призводило до нервово-психічним порушенням, неврастенічних і депресивних розладів.
Медикаментозне лікування цих хворих давало тимчасовий ефект. Частота рецидивів захворювання коливалася від 3 до 12 разів на рік і склала 4,8+/-1,2 рази на рік, середня тривалість ремісії була 2,4+/-0,8 міс. Всі пацієнтки мали регулярний менструальний цикл. Статевим життям поза шлюбу жили 8 жінок, решта 12 складалися в шлюбі. Зміна 2-3 статевих партнерів і більше мала місце у всіх пацієнток. Вдалося з’ясувати, що у 4 статевих партнерів періодично на статевих органах відзначалися герпетичні висипання.
У 4 (20%) пацієнток досліджуваної групи було невиношування вагітності, 2 (10%) жінки страждали безпліддям. У всіх хворих з типовою формою генітального герпесу відзначався хронічний сальпінгоофорит.
Для ендоваскулярного лазерного опромінення крові використовували гелій-неонове випромінювання з застосуванням апарату УЛФ-01. Потужність випромінювання на виході склала 1 мВт, довжина хвилі — 0,63 нм, час експозиції — 15-30 хв. Процедури проводилися щодня протягом 7-10 днів. Одночасно здійснювалося лікування статевих партнерів пацієнток досліджуваної групи лікарськими засобами та ЭЛОК. Забір крові у хворих проводився з ліктьової вени до і після курсу ЭЛОК. У жінок контрольної групи забір крові для дослідження проводили одноразово на 5-б-й день менструального циклу.
Для дослідження клітинних і макромолекулярних компонентів використовувався електронно-мікроскопічний препарат концентрату клітин периферичної крові. Вивчали еритроцити, тромбоцити, гранулоцити, лімфоцити, моноцити і компоненти плазми, що знаходяться між клітинами: ультрамикрофибриллы, ультрамикрогранулы, макромолекулярні комплекси, фрагменти клітин і атипові компоненти. Досліджувану венозну кров з гепарином відстоювали 15-20 хв, використовували верхній шар плазми утворився лейкоконцентрата. Зібрану в конічні пробірки плазму з клітинами центрифугували при швидкості 1000 об/хв протягом 10 хв Надосадову рідину видаляли, а до осаду доливали для префиксации клітин 1% розчин глутаральдегід на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4) і центрифугували протягом 10 хв, а потім 3 рази промивали в процесі центрифугування в буферному розчині і додатково фіксували 1% розчином четырехокиси осмію на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4) протягом 30 хв. Після закінчення процедури фіксації електронно-мікроскопічний препарат концентрату клітин крові готувався за звичайною методикою [2,3].
Ультратонкі зрізи отримували з допомогою ультрамикротома LKB-V (Швеція), контрастували уранил-ацетатом і цитратом свинцю, аналізували і фотографували на трансмісійному електронному мікроскопі JEM-100 CX (Японія). Досліджували кілька ультратонких зрізів кожного експериментального варіанту і паралельних препаратів, оцінювали якісні та кількісні ультраструктурні ознаки клітин і клітинних популяцій. Важливо підкреслити, що приготовані описаним способом електронно-мікроскопічні препарати структурних компонентів периферичної крові дозволяють вивчати клітини в їх природному сукупності без попереднього ушкоджуючої фракціонування, оскільки тільки електронна мікроскопія дає можливість досліджувати як завгодно складну структурну суміш. Крім того, попередня процедура обробки клітин крові, що включає осадження і центрифугування, як би повторює стадії ряду імунологічних тестів (наприклад, реакції розеткоутворення тощо), внаслідок чого створюються умови для контактної взаємодії клітин. Перераховані умови сприяють виявленню найбільш повного різноманітності функціональних станів клітин крові.
В результаті електронно-мікроскопічного дослідження структурних компонентів крові у хворих до початку ЭЛОК виявлено наявність залишків мікроорганізмів між клітинами крові, які були, очевидно, в стані деструкції внаслідок дії імунних механізмів (рис. 1, 2). Однак мікроорганізми знаходили і всередині клітин (лімфоцитах), але в спорообразном стані (наявність товстої оболонки). Спостерігався також фагоцитоз нейтрофілами фрагментів клітин, що містять мікроорганізми (рис. 3,4).
Поряд з виявленням мікроорганізмів в крові були виявлені і ознаки цитопатичної ефекту, які можна імовірно пов’язати з вірусною інфекцією. Так, спостерігалися пошкодження поверхневої мембрани еритроцитів у вигляді почкообразных випинань, часто отрывающихся від клітини в навколишнє плазму (рис. 5, 6). Вирусоподобные частинки також спостерігалися в углубленнях еритроцитів (рис. 7). Цитопатический ефект в більш яскравому вигляді виявлявся при дослідженні тромбоцитів: на їх поверхні були тонкі короткі і довгі відростки, а поруч безліч вирусоподобных частинок (рис. 8). У міжклітинній плазмі також знаходили скупчення вирусоподобных часток, розділених і контактують між собою (рис. 9, 10). Серед клітин були сильно пошкоджені клітини (цитолітична стан) або їх великі фрагменти, в яких можна було бачити безліч вирусоподобных частинок, часто прилягають до внутрішньої поверхні мембрани клітин.
Подібна ультраструктурная картина периферичної крові була виявлена і після курсу ЭЛОК, але значно частіше відзначалося присутність бактерій і вирусоподобных частинок поза клітин, міжклітинної плазмі або у фрагментах зруйнованих клітин. У міжклітинній плазмі виявлені висока контрацепція (щільність) неклеточных компонентів у вигляді макромолекулярних пластівців і висока активація тромбоцитів, нейтрофілів, лімфоцитів і моноцитів, яка виражалася у вигляді дегрануляції (вивільнення специфічних гранул і лізосом), реакції фагоцитозу та синтезу імуноглобулінів у розвиненій гранулярной ендоплазматичної мережі (активовані В-лімфоцити), а також у вигляді сильної контактної активності і особливо в місцях знаходжень бактерій і вирусоподобных частинок (рис. 11, 12).
Рис. 1. Контактна взаємодія нейтрофіла, шиповидного еритроцита і активованого лімфоцита. Поряд група з 8 мікроорганізмів.
Рис. 2. Група з 4 мікроорганізмів поруч з эритроцитом, біля них макромолекулярні комплекси.
Рис. 3. Лімфоцит, в цитоплазмі якого знаходиться мікроорганізм в спорообразмом стані. Поруч активовані тромбоцити, між якими висока щільність макромолекулярних комплексів та наявність вирусоподобных частинок.
Рис. 4. Нейтрофіл, який містить фагоцитированный фрагмент, очевидно, лімфоцита з мікроорганізмом в спорообразном стані. Поруч активовані тромбоцити і дрібні фрагменти клітин і вирусоподобные частинки.
Рис. 5. Вирусоподобная нирка на поверхні еритроцита, поруч мікроорганізм і макромолекулярні комплекси.
Рис. 6. Почкообразниє утворення на поверхні еритроцита, поруч вирусоподобные частинки.
Рис. 7. Щільні контакти між еритроцитами, нирка на поверхні і вирусоподобная частка у впячивании еритроцита.
Рис. 8. Активоване тромбоцит і вирусоподобные частинки всередині, на поверхні і поруч.
Рис. 9. Фрагмент клітини крові, що містить вирусоподобные частинки, поруч в контакті активовані тромбоцити і макромолекулярні комплекси.
Рис. 10. Скупчення контактних вирусоподобных частинок, висока щільність макромолекулярних комплексів і активовані тромбоцити.
Рис. 11. Активоване В-лімфоцит, в цитоплазмі антителпродуцирующая мембранна мережа, поруч активовані тромбоцити і нейтрофіли, між клітинами висока щільність макромолекулярних комплексів.
Рис. 12. Активоване моноцит з фагосомой, в контакті інший активоване моноцит, поруч активовані тромбоцити, вирусоподобные частинки і висока щільність макромолекулярних комплексів.
Подібних змін при електронно-мікроскопічному дослідженні периферичної крові у здорових жінок не спостерігалося.
Таким чином, багатофакторний електронно-мікроскопічний аналіз структурних компонентів периферичної крові у жінок з генітальним герпесом дозволив отримати певне уявлення про лікувальному ефекті ЭЛОК. Відомо, що при лазерному опроміненні клітин крові in vitro відзначена висока фоточутливість еритроцитів, що містять природний пігмент гемоглобін і володіють великою светопоглощающего здатністю. Разом з тим деякі автори показали, що лазерне опромінення клітин крові, не викликаючи ушкодження еритроцитів людини, зумовлює підвищення їх резистентності, активацію функції мембрани клітин із зміною електричних і сорбційних властивостей її поверхні [5]. Вплив на лімфоцити червоним світлом гелій-неонового лазера з довжиною хвилі 0,63 нм надає стимулюючий вплив на їх функціональну активність, активує імунокомпетентні клітини крові [9]. При морфологічному дослідженні периферичної крові спостерігається підвищення вмісту нейтрофілів, еозинофілів, базофілів, моноцитів [11]. Це пов’язано зі стимуляцією лейкопоезу, з викидом зрілих клітин з синусів кісткового мозку, судин селезінки та легенів. Основною точкою докладання дії лазерного гелій-неонового випромінювання в лімфоцитах є поверхнева мембрана клітини з її рецепторами і ядерце, які активізувалися при лазерному впливі. Є також достатні підстави пов’язати збільшення в крові кількості нейтрофілів і моноцитів в стані сильно вираженої активації з високим рівнем імунних і антигенних комплексів, фрагментів клітинних рецепторів. У зв’язку з цим, активацію нейтрофілів, моноцитів можна віднести до компенсаторним процесам, спрямованим на вилучення з кровоносного русла в плазму зруйнованих інфекційних агентів під впливом гелій-неонового випромінювання. Никоэнергетическое лазерне опромінення крові насамперед викликає руйнування пошкоджених клітин з виходом бактерій і вірусів з клітин в міжклітинну плазму, де вони в свою чергу стають доступними для імунокомпетентних клітин і знешкоджуються в процесі фагоцитозу, дії специфічних імуноглобулінів з подальшим контактним зв’язуванням імунних комплексів для нейтралізації інфекційних частинок. Таке представлення підтверджується присутвием в периферичній крові у пацієнток высокоактивированных тромбоцитів, нейтрофілів, лімфоцитів і моноцитів на тлі високої концентрації в плазмі макромолекулярних компонентів. У плазмі вони піддаються впливу імунокомпетентних клітин.
Ці результати узгоджуються з вірусологічними дослідженнями, проведеними через 2-3 тиж. після лазеротерапії. Виявлено незначне збільшення екскреції вірусів. Крім того, у 5 жінок в перший тиждень після лазеротерапії відзначалися легкі явища ГРЗ, що було розцінено як активація елімінації вірусів слизової оболонки верхніх дихальних шляхів. За результатами катамнеза і спостереження пролікованих пацієнток протягом 2-8 міс. виявлено збільшення тривалості ремісії на 5,4-1,1 міс. Після повторного обстеження у 72% випадків вірус простого герпесу не виявлено.
Таким чином, реакція крові, що розвивається при лазерному опроміненні, є однією з важливих складових клінічного ефекту биостимуляционной лазерної терапії. Виявлені в даній роботі ультраструктурні особливості стану еритроцитів, тромбоцитів, нейтрофілів, моноцитів і неклеточных макромолекулярних компонентів периферичної крові у жінок з генітальним герпесом, як нам видається, дають більш повну інформацію для розуміння впливу лазерного випромінювання на вірусну інфекцію. ЭЛОК може стати методом вибору лікування хворих з даною патологією.
ЛІТЕРАТУРА
1. Баринский В. Ф., Шубладзе A. K., Каспаров А. Л., Гребенюк Ст. Н. Герпес. М., 1986. 205 с.
2. Бонарцев П. Д., Демидова Е. М.// Акуш. гін. 1987. №10. С. 15-18.
3. Бонарцев П. Д., Демидова Е. М.// Вестн. АМН СРСР. 1990. № 5. С. 23-25.
4. Іванов А. В., Купин в. І., Польова Е. Б., Бучиладзе Л. В./Актуальні питання імунотерапії пухлин. Рига, 1988. С. 119-120.
5. Инюшин В. М., Шабаєв В. П.// Біологічна дія лазерного опромінення. Межвуз. збірник, Куйбишев: Куйб. держ. ун-т, 1984. С. 23-29.
6. Калашкарян А. А., Делекторский В. В. та інші// Вести, дерматол. 1982. № 4. С. 4-7.
7. Козлов в. І., Буйлин Ст. А. Внутрішньовенна лазеротерапія// Лазеротерапія. М., 1993. С. 72-79.
8. Константинова В. В., Калашкарян А. А. та ін// Імунологія. 1981. № 2. С. 36-39.
9. Косинська Н.П.// Тези доповідей 4-го Всесоюзного з’їзду онкологів. Л., 1986. С. 527.
10. Кузник Б. В., Васильєв Н.В., Цыбиков Н.Н. Імуногенез, гемостаз і неспецифічна резистентність організму. М.: Медицина, 1989. 280 с.
11. Кузьміна Ст. Е., Варижников Ю. А.// Біологічна дія лазерного випромінювання. Межвуз. збірник. Куйбишева: Куйб. держ. ун-т. 1984. С. 51-60.
12. Мальцева І. Н., Эбралидзе Л. К., Звонарьов А. Ю.// Збірник наукових праць НДІ епідеміології, мікробіології та інфекційних хвороб. МОЗ Каз. РСР. 1988. Т. 36. С. 135-141.
13. Семенова Тобто, Посевая Т. А. та ін// Вести, дерматол. 1987. № 6. С. 43-47.
14. Becker Т. М., Stone К. М., Cates W.// J. reprod. Меd 1986. Vol. 31. № 5. P. 358-363.
15. Boulanger G. C. D., Gandry G.// Gynecologie. 1986. Vol. 37. № 1. bis. P. 32-39.
16. Coleman R. M., L. Pereira, Baileu P. D. et al.// J. Clin. Microbiol. 1983. Vol. 18. P. 287-291.
17. Kahlon J., Lakeman F. D., Ackerman M./ /J. Cln. Microbiol. 1986. № 6. P. 725-730.
18. Richard J., Deuman M. D.// J. reprod. Med. 1986. Vol. 31. №5. P. 454-464.
19. Sweet R. L., Gibbs R. S.// Infections diseases the female генітальний tract: Second edition. 1990. P. 145-169.
20. //Pediatrics. 1980. Vol. 66. P. 489-494.
