Дослідження потенційного ризику зараження сифілісом через препарати крові

М. Н. Гаджимурадов, С. М. Максудова, А. М. Амінів.

Центральний шкірно-венерологічний інститут МОЗ і МП РФ, Дагестанська державна медична академія МОЗ і МП РФ.

З донорської крові проводиться цілий ряд препаратів крові, серед яких тільки альбуміни під час технологічного циклу піддаються термічній обробці, достатньої для знищення блідої трепонеми [1, 3, 5, 6]. Крім альбумінів, виготовляється велика кількість препаратів, які не піддаються такій обробці:

кріопреципітат;

імуноглобуліни — антистафілококовий, антивірусний, протиправцевий;

імуноглобулін проти гепатиту В, імуноглобулін людини нормальний;

сироватки — антистафілококовий, антипротейная, антисинегнойная, антидифтерийная, антиэндотоксиновая;

тромбін;

інтерферон внутрішньовенного та інтраназального застосування;

фібринолізин;

фібриноген;

біологічний антисептичний тампон і інші (S).

При виробництві лікарських препаратів в обробку одночасно потрапляє кров від 5-6 тисяч донорів. Згідно інструкції по заготівлі та консервування донорської крові (1995), у разі виявлення сифілісу у одного з донорів вся кількість сировини або готової продукції, знищується.

Технологічний процес виробництва названих препаратів крові передбачає зберігання консервованої плазми протягом 30 діб при t = +4+/- 2о, а також вплив 8о і 25о етиловим спиртом протягом 24 годин. Обробка відбувається у кислому середовищі (використовується оцтова кислота при рН=5,2). Передбачається також 3-4 кратне заморожування (-20с) і подальше відтавання (до +8оС) матеріалу, що призводить до руйнування клітинних оболонок. Можливо, багато хто з цих чинників згубно впливають на бліду трепонем [4].

Проведено експериментальне дослідження, метою якого було встановити вплив ряду технологічних факторів, що використовуються при виробництві препаратів крові, на життєздатність збудника сифілісу.

Рухливість і патогенність блідих трепонем штаму Никольса вивчалася в умовах, максимально наближених до виробничих: в плазмі консервованої, у спиртовому та оцтовому розчинах плазми крові, а також при заморожуванні і відтаванні. У всі розчини додавали завись блідих трепонем до змісту в кожному полі зору 25-30 мікроорганізмів.

Консервовану плазму (консервант «Глюгицир»), що містить бліді трепонеми, зберігали при t = +4+/- 2оС протягом 30 діб.

Плазму крові з додаванням етилового спирту (8о) зберігали 24 години при t = -2оС. Кислий розчин плазми крові (рН оцтової кислоти = 5,2) протягом 18 годин зберігали при t = 0оС. Консервовану плазму з блідими трепонемами тричі заморожували (t = -20оС) і відтавали.

Рухливість блідих трепонем в препаратах, приготовлених з вищевказаних розчинів, вивчали в темному полі зору мікроскопа.

В результаті мікроскопічного дослідження встановлено, що консервована плазма крові до 5-го дня зберігання при t = +4+/- 2оС не містить рухомих блідих трепонем, а на 22-е добу в ній вже відсутні і нерухомі мікроорганізми (таблиця 1). Зберігання плазми крові, що містить бліді трепонеми з додаванням етилового спирту, призводить через півгодини до різкого зниження числа рухомих блідих трепонем (таблиця 2). У препараті менше половини мікроорганізмів рухливі, переважають трепонеми з ротаторными рухами. До кінця першої години в кожному полі зору мікроскопа було до 3-4 вялоподвижных мікроорганізмів, контрактильні руху були відсутні. Відзначалося зниження кількості блідих трепонем до 4-17 в кожному полі зору. Мікроорганізми були потовщені і вкорочені. Ще через годину лише поодинокі бліді трепонеми були мляво рухливі і, в основному, за рахунок ротаторных рухів. Тривало зниження кількості блідих трепонем до 11 у полі зору мікроскопа. Морфологічні зміни були значно виражені: вкорочення, потовщення і разволокнение мікроорганізмів. А через 2 години 30 хвилин з моменту початку експерименту, рухливі бліді трепонеми були відсутні у досліджуваних препаратах і число мікроорганізмів було знижено до 6-10 в полі зору.

Таблиця 1. Вплив строків зберігання плазми консервованої крові на рухливість блідих трепонем.

Таблиця 2. Вплив 8о спиртового розчину на рухливість блідих трепонем.

Морфологічні зміни представлені значним укороченням, потовщенням і разволокнением блідих трепонем.

Досліджувана кисле середовище призводить до знерухомлення блідих трепонем протягом 40 хвилин, а восемнадцатичасовое зберігання в ній — до повного лізису трепонем (таблиця 3). З таблиці видно, що до початку дослідження всі бліді трепонеми були рухливі, переважали ротаторные і згинальні рухи. Через 20 хвилин з’явилося до 16 нерухомих мікроорганізмів, а кількість рухомих зменшилася до 9. Бліді трепонеми з контрактильним рухами були відсутні, спостерігалися мікроорганізми з ротаторными і згинальними рухами. Ще через 20 хвилин у всіх полях зору мікроскопа рухливі мікроорганізми відсутні, число нерухомих зросла. Та ж мікроскопічна картина збереглася протягом наступних 20 хвилин. А до кінця другої години відзначалося зниження блідих трепонем до 12 в кожному полі зору. Спостерігалися морфологічно змінені, скорочені і потовщені мікроорганізми. Через 18 годин зберігання в плазмі бліді трепонеми були відсутні. Це спостереження дозволяє зробити висновок, що консервування з оцтовою кислотою (рН = 5,2) викликає такі морфологічні зміни блідих трепонем, які призводять до їх руйнування.

Таблиця 3. Вплив оцтової кислоти на рухливість блідих трепонем, що містяться в плазмі консервованої крові.

При дворазовому заморожування (-20с) і відтаванні консервованої плазми крові, що містяться в ній бліді трепонеми втрачають рухливість, при трикратному — повністю руйнуються (таблиця 4).

Таблиця 4. Зміна рухливості блідих трепонем в плазмі консервованої крові при триразовому заморожуванні і відтаванні.

При мікроскопічному дослідженні препарату з крові, що зберігалася 7 діб при температурі -20оС, виявилося, що більшість блідих трепонем нерухомі, причому вони вкорочені і потовщені. До 4-х мікроорганізмів у полі зору мікроскопа помірно рухомі, в основному, за рахунок ротаторных рухів. Відзначалося значне зменшення кількості блідих трепонем щодо початкової концентрації.

При повторному відтаванні плазми консервованої крові, що зберігалася 14 діб при температурі -20оС, рухливі бліді трепонеми в ній були відсутні. Відзначалося зниження кількості блідих трепонем до 3 в кожному полі зору. Морфологічні зміни були значно виражені: спостерігалося вкорочення, потовщення і разволокнение мікроорганізмів.

На 21-й день зберігання вміст колби відтавали втретє і готували препарат для мікроскопічного дослідження зберігалися замороженими в плазмі блідих трепонем. Ні в одному полі зору мікроскопа мікроорганізми не виявлені.

З огляду на теоретичну можливість збереження змінених блідих трепонем (зерна, гранули), було проведено вивчення ризику зараження отриманих напівфабрикатів і готових препаратів крові на 73 кроликах — самцях масою 2,5-3 кг, у яких серологічні реакції на сифіліс (КСР, РІТ і РІФ-200) були негативними. Кожному кролику вводили по 0,75 мл препарату внутрішньошкірно з кожної сторони мошонки.

Протягом 6 місяців після ін’єкцій кролики перебували на клініко-серологічному контролі. Тварин оглядали кожні 2 тижні протягом перших 2 місяців, потім — раз на місяць; кров для дослідження в КСР брали з крайової вени вуха раз в місяць, в РІТ і РІФ-200 — раз в 3 місяці. Після закінчення спостереження у кроликів видаляли підколінні лімфатичні вузли і перевивали їх здоровим кроликам 1-го пасажу, а від них через 6 місяців спостереження — кроликам 2-го пасажу. За пассажными кроликами проводили клініко-серологічне спостереження; вихідних кроликів і тварин 1-го пасажу після видалення лімфатичних вузлів, а кроликів 2-го пасажу через 4-6 місяців спостереження заражали внутрішньошкірно на мошонці суспензією патогенних блідих трепонем штаму Никольса з тим, щоб переконатися у відсутності в них прихованого сифілісу.

Всі кролики задовільно перенесли їх введення. У однієї тварини, зараженого консервованої плазмою з патогенними блідими трепонемами, відзначалася набряклість правого яєчка, а на шкірі мошонки праворуч утворилася кров’янистої-гнійна кірка діаметром 0,5 см. На 2-му місяці набряк регресував, кірка відпала, на шкірі мошонки залишився рубець діаметром 0,2 див. В наступні 4 місяці клініко-серологічного спостереження кролик залишався серологічно здоровий. Вищеописана кірка на шкірі мошонки була розцінена як результат випадкової травми шкіри під час зараження. В одного кролика на першому місяці спостереження були позитивні результати КСР (реакція Вассермана з трепонемным антигеном — 2+, неспецифічним — 4+, кардиолипиновым — 4+). Однак повторне серологічне дослідження через 7 днів і в наступні місяці спостереження дали негативні результати.

Клініко-серологічне спостереження за іншими тваринами не виявило у них ознак сифілітичної інфекції. Вони залишались клінічно здоровими, а КСР, РІТ і РІФ-200 були негативними.

Від 69 залишилися в живих кроликів через 6 місяців спостереження проведений пасаж лімфатичних вузлів здоровим кроликам 1-го пасажу і потім через 6 місяців від 62 кроликів 1-го пасажу кроликам 2-го пасажу. При спостереженні за цими кроликами також не виявлено клінічних проявів сифілісу, серологічні реакції збереглися негативними протягом всього експерименту. Всі кролики після закінчення спостереження були реинфицированы суспензією блідих трепонем штаму Никольса, що призвело до розвитку твердих шанкрів у всіх тварин, а результати серологічних реакцій, досліджених через 1,5 місяця, були різко позитивними.

Таким чином, в експерименті in vitro і на кроликах in vivo показано високу ефективність виробничих факторів при знезараженні сировини, що містить патогенні бліді трепонеми штаму Никольса.

Література.

1. Гаврилов O. K. Розвиток трансфузіології та основні досягнення служби крові СРСР.// Проблеми гематології та трансфузіології: Ювілейний зб. наук. робіт до 50-річчя ЦНИИГПК. — М., 1976. — T. 1. — С. 24-42.

2. Жибург Б. Б., Сидоркевич С. В., Бондарчук Ю. В. Віруси і сепсис: широкий спектр взаємин.// Сепсис. Актуальні питання клініки і експерименту; Сб. навч. тр. — Махачкала, 1997. — С. 20-23.

3. Русанов Б. М., Розенберг Р. Я. Типовий комплексний регламент виробництва білкових препаратів плазми донорської крові. — М. 1979. — 303 с.

4. Профілактика трансфузионного сифілісу: укладе. звіт про НДР/ Вик. Ротанов С. В., Сергєєва Е. В. М.: — ЦКВІ, 1984. — 21 с.

5. Фром А. А., Скобелєв Л. В., Русанов В. М. Білки плазми і їх фракціонування у виробництві препаратів крові. — М: Медицина, 1974. — 251 с.

6. Jamieson G. A. The development of plasma perivatives for clinical use.// Proc. of the American Real Cross Symposium. — Washington, D. C., October 1971. «Vox Song».